1 Mộtnguyên lý ction
Hygromycin B là một loại kháng sinh aminoglycoside được sản xuất thông qua quá trình chuyển hóa của Streptomyces hygroscopicus, có tác dụng ức chế tổng hợp protein bằng cách phá vỡ quá trình chuyển vị và thúc đẩy quá trình đọc sai ribosome 80S, do đó tiêu diệt tế bào nhân sơ và nhân thực.
Hiện nay, phương pháp này thường được sử dụng để sàng lọc và duy trì tế bào nhân sơ hoặc nhân thực có chứa gen kháng hygromycin.
2 Ứng dụng
2.1 Kiểm tra và duy trì nuôi cấy tế bào nhân sơ hoặc nhân thực (tế bào thực vật và tế bào động vật có vú) được chuyển gen ổn định bằng Hph+các vectơThuốc Hygromycin B gen kháng thuốc (hyg hoặc hph) có nguồn gốc từ Escherichia coli. mã hóa cho enzyme phosphotransferase hygromycin B, chuyển đổi hygromycin B thành sản phẩm phosphoryl hóa không có hoạt tính sinh học, do đó giải độc. Theo nguyên tắc này, hygromycin B là một dấu hiệu có thể lựa chọn rất hữu ích để sàng lọc và duy trì các tế bào nhân sơ hoặc nhân thực được nuôi cấy thành công được chuyển gen kháng thuốc hygromycin.
2.2Do sự khác biệt về cơ chế tác động, hygromycin B thường được sử dụng kết hợp với geneticin G418, bleomycin và blasticidin để sàng lọc các dòng tế bào được chuyển gen ổn định bằng hai vectơ khác nhau.Hygromycin B có cơ chế hoạt động khác với G418 (Cat#60220ES), Bleomycin (Cat#60257ES) và Blasticidins (Cat#60218ES), do đó nó rất phù hợp để sử dụng kết hợp với các loại kháng sinh chọn lọc khác trong các thí nghiệm chọn lọc kép.
2.3 Thuốc kháng vi-rút2.4 Là thuốc tẩy giun, được thêm vào thức ăn chăn nuôi và dùng để nuôi gia súc.
2.5 Sàng lọc các tế bào được chuyển gen ổn định
Nồng độ làm việc của hygromycin B dùng để sàng lọc các tế bào chuyển gen ổn định thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, môi trường, điều kiện tăng trưởng và tốc độ chuyển hóa tế bào. Nồng độ khuyến cáo là 50-1000 μg/mL. Đối với lần sử dụng đầu tiên của hệ thống thử nghiệm, khuyến cáo nên xác định nồng độ sàng lọc tối ưu bằng cách thiết lập đường cong tiêu diệt, tức là đường cong liều lượng-đáp ứng. Nhìn chung, 50-500 μg/mL đối với tế bào động vật có vú; 20-200 μg/mL đối với tế bào vi khuẩn/thực vật; 200-1000 μg/mL đối với nấm.
3 Giao thức
3.1 Chuẩn bị dung dịch bảo quản (50 mg/mL)
Cân 0,5 g hygromycin B và thêm 10 mL 1×PBS, pH 7,4. Sau khi hòa tan hoàn toàn, lọc bằng bộ lọc 0,22 μm để khử trùng. Chia nhỏ dung dịch đã khử trùng và bảo quản ở -20℃.
3.2 Nồng độ sàng lọc thường dùng
Nồng độ làm việc của hygromycin B để sàng lọc các chủng ổn định thay đổi tùy theo loại tế bào, môi trường nuôi cấy, điều kiện tăng trưởng và tốc độ chuyển hóa tế bào. Nên thiết lập đường cong tiêu diệt (đường cong liều lượng-đáp ứng) để xác định nồng độ sàng lọc tối ưu lần đầu tiên. Nhìn chung, tế bào động vật có vú: 50-500 μg/mL; Tế bào vi khuẩn/thực vật: 20-200 μg/mL; Nấm: 300-1000 μg/mL.
3.3 Thiết lập đường cong giết chết
【Lưu ý】Để sàng lọc các dòng tế bào ổn định, cần xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu có khả năng tiêu diệt các tế bào chủ chưa chuyển gen. Có thể đạt được điều này bằng cách thiết lập đường cong tiêu diệt (đường cong liều lượng-đáp ứng). Cần sắp xếp ít nhất năm nồng độ.
1) Ngày 1: Các tế bào chưa chuyển gen được đặt trong đĩa nuôi cấy thích hợp với mật độ tế bào 20-25% và nuôi cấy qua đêm.【Lưu ý】Có thể tăng lượng tế bào tiêm chủng đối với các tế bào cần mật độ cao hơn để phát hiện sức sống.
2) Đặt nồng độ gradient trong phạm vi thích hợp theo loại tế bào. Tế bào động vật có vú có thể đặt 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/mL. Pha loãng dung dịch Hygromycin B theo tỷ lệ 1:10 với nước khử ion hoặc đệm PBS thành 5 mg/mL. Sau đó pha loãng dung dịch thành nồng độ làm việc tương ứng theo bảng sau.
| Nồng độ cuối cùng (μg/mL) | Thể tích trung bình (mL) | Thể tích bổ sung 5 mg/mL Hygromycin B (mL) |
| 50 | 9,9 | 0,1 |
| 100 | 9.8 | 0,2 |
| 250 | 9,5 | 0,5 |
| 500 | 9.0 | 1.0 |
| 750 | 8,5 | 1,5 |
| 1000 | 8.0 | 2.0 |
3) Ngày 2: Thay thế bằng môi trường mới chuẩn bị có chứa nồng độ thuốc tương ứng. Làm ba mẫu song song cho mỗi nồng độ.
4) Thay môi trường mới có chứa thuốc sau mỗi 3-4 ngày.
5) Đếm tế bào sống được thực hiện theo chu kỳ cố định (ví dụ, cứ 2 ngày một lần) để xác định nồng độ thích hợp nhằm ngăn chặn sự phát triển của các tế bào chưa chuyển gen. Chọn nồng độ tối thiểu tiêu diệt phần lớn các tế bào trong số ngày lý tưởng (thường là 7-10 ngày), làm nồng độ làm việc để sàng lọc dòng tế bào ổn định.
3.4 Sàng lọc các tế bào chuyển gen ổn định
1) 48 giờ sau khi chuyển gen, các tế bào được nuôi cấy lại bằng môi trường sàng lọc có chứa hygromycin B ở nồng độ thích hợp (trực tiếp hoặc pha loãng). 【Lưu ý】Kháng sinh có tác dụng tốt nhất đối với các tế bào đang phân chia tích cực. Nếu các tế bào quá dày đặc, kháng sinh sẽ không tiêu diệt được các tế bào. Chia các tế bào sao cho các tế bào không quá 25% hợp lưu.
2) Thay môi trường sàng lọc sau mỗi 3-4 ngày.
3) Đo sự hình thành khuẩn lạc tế bào sau 7 ngày sàng lọc. Sự hình thành khuẩn lạc có thể mất thêm một tuần hoặc lâu hơn, tùy thuộc vào loại tế bào chủ, quá trình chuyển gen và hiệu quả sàng lọc.
4) Chọn 5-10 dòng kháng thuốc và chuyển vào đĩa nuôi cấy tế bào 35 mm, nuôi trong môi trường sàng lọc có chứa thuốc trong 7 ngày.
5) Thay môi trường mới không có thuốc để nuôi cấy.
4 Thuộc tính
Hygromycin B là bột màu trắng đến nâu vàng, có mùi đặc biệt, dễ tan trong nước, methanol, ethanol... và dễ tạo thành muối với nhiều loại axit hữu cơ và vô cơ.
5 Lưu trữ sản phẩm
Dung dịch có thể được bảo quản trực tiếp ở nhiệt độ 2~8℃ và có thể bảo quản trong thời gian hơn 6 tháng.
6 Thận trọng
1) Các tế bào được chuyển gen hph có khả năng kháng hygromycin và các tế bào được chuyển gen biểu hiện gen ổn định hoặc tạm thời.
2) Gen kháng hygromycin B (hyg hoặc hph) được tìm thấy ở các chủng khác, bao gồm Streptomyces hygroscopicus và Klebsiella pneumoniae, ngoài E. Coli.
7 Đề xuất sản phẩm
| Tên sản phẩm | Con mèo# | Đặc điểm kỹ thuật |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | 60224ES03 | 1g (20mL) |
| 60224ES10 | 10×1 g (20 mL) | |
| Hygromycin B | 60225ES03 | 1g |
| 60225ES10 | 10g |
8 bài báo đã xuất bản với thuốc thử của chúng tôi
[1] Zhao Q, Zheng K, Ma C, et al. PTPS tạo điều kiện cho quá trình LTBP1 S-Nitrosyl hóa phân chia và thúc đẩy sự phát triển của khối u trong điều kiện thiếu oxy. Tế bào Mol . 2020;77(1):95-107.e5. doi:10.1016/j .molcel.2019.09.018 (NẾU:14.548)
[2] Wu LY, Shang GD, Wang FX, et al. Hồ sơ trạng thái chromatin động cho thấy vai trò điều hòa của auxin và cytokinein trong quá trình tái sinh chồi. Tế bào phát triển . 2022;57(4):526-542.e7. doi:10.1016/ j.devcel.2021.12.019 (NẾU:12.270)
[3] Zhang TQ, Chen Y, Wang JW. Phân tích tế bào đơn của đỉnh chồi sinh dưỡng của Arabidopsis. Tế bào phát triển . 2021;56(7):1056-1074. e8. doi:10.1016/j.devcel.2021.02.021 (NẾU:12.270)
[4] Wang FX, Shang GD, Wu LY, Xu ZG, Zhao XY, Wang JW. Động lực tiếp cận chromatin và cấu trúc mạng điều hòa phiên mã phân cấp cho quá trình phôi soma thực vật. Tế bào phát triển . 2020;54(6):742-757.e8. doi:10.1016/j.devcel.2020.07.003 (NẾU:10.092)
[5] Zhu GD, Yu J, Sun ZY, et al. Kiểm tra CRISPR/Cas9 trên toàn bộ hệ gen xác định CARHSP1 chịu trách nhiệm về khả năng kháng bức xạ ở bệnh u nguyên bào thần kinh đệm. Tế bào chết Dis . 2021;12(8):724. Xuất bản ngày 21 tháng 7 năm 2021. doi :10.1038/s41419-021-04000-3 (NẾU:8.469)
[6] Chen J, Huang Y, Tang Z, et al. Sàng lọc kích hoạt phiên mã CRISPR-Cas9 quy mô hệ gen trong gen liên quan đến kháng metformin của ung thư tuyến tiền liệt. Front Cell Dev Biol . 2021;8:616332. Xuất bản ngày 26 tháng 1 năm 2021. doi:10.3389/fcell.2020.616332 (NẾU:6.684)
[7] Jiang Z, Cui Z, Zhu Z, et al. Kỹ thuật vận chuyển Yarrowia lipolytica để sản xuất axit succinic có nguồn gốc sinh học từ glucose hiệu quả cao. Công nghệ sinh học Nhiên liệu sinh học . 2021;14(1):145. Xuất bản ngày 27 tháng 6 năm 2021. doi:10.1186/s13068-021-01996-w (NẾU:6.040)
[8] Liu Y, Jiang X, Cui Z, Wang Z, Qi Q, Hou J. Thiết kế nấm men dầu Yarrowia lipolytica để sản xuất α-farnesene. Công nghệ sinh học Nhiên liệu sinh học . 2019;12:296. Xuất bản ngày 23 tháng 12 năm 2019. doi:10.1186/s13068-019-1636-z (NẾU: 5.452)
[9] Zhou C, Zeng Z, Suo J, et al. Điều khiển một yếu tố phiên mã đơn lẻ, Ant1, thúc đẩy sự tích tụ anthocyanin trong hạt lúa mạch. J Agric Thực phẩm Hóa học . 2021;69(18):5306-5317. doi:10.1021/acs.jafc.0c08147 (IF:5.279)
[10] Cui Z, Zheng H, Jiang Z, và những người khác.Xác định và mô tả nguồn gốc sao chép ty thể cho biểu hiện ổn định và biểu hiện episomal ở Yarrowia lipolytica. ACS Tổng hợp Sinh học . 2021;10(4):826-835. doi:10.1021 /acssynbio.0c00619 (NẾU: 5.110)
9 Sản phẩm liên quan
| Tên sản phẩm | Con mèo# | Đặc điểm kỹ thuật |
| Ciprofloxacin hydroclorid | 60201ES05/25/60 | 5/25/100g |
| Ampicillin, Muối Natri | 60203ES10/60 | 10/100g |
| Doxycycline hyclate | 60204ES03/08/25 | 1/5/25g |
| Cloramphenicol, Cấp độ USP | 60205ES08/25/60 | 5/25/100g |
| Kanamycin sulfat | 60206ES10/60 | 10/100g |
| Tetracyclin HCl Tetracycline hydrochloride (USP) | 60212ES25/60 | 25/100g |
| Vancomycin Hydrochloride | 60213ES60/80/90 | 100mg/1g/5g |
| Muối Gentamycin Sulfate | 60214ES03/08/25 | 1/5/25g |
| Spectinomycin Hydrochloride | 60215ES08 | 5g |
| Phleomycin (20 mg/mL trong dung dịch) | 60217ES20/60 | 20/5×20mg |
| Thuốc Blasticidin S (Blasticidin) | 60218ES10/60 | 10/10×10mg |
| Nystatin | 60219ES08 | 5g |
| G418 Sulfate (Geneticin) | 60220ES03/08 | 1/5g |
| Puromycin (Dung dịch 10 mg/mL) | 60209ES10/50/60/76 | 1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 mL |
| Puromycin Dihydrochloride | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500mg / 1g |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | 60224ES03 | 1 g (20 mL)/10×1 g (20 mL) |
| Hygromycin B | 60225ES03/10 | 1/10g |
| Thuốc Erythromycin | 60228ES08/25 | 5/25g |
| Thời gian | 60230ES07/32 | 3.2/10×3.2g |
| Aureobasidin A (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1mg |
| Polymyxin B sulfat | 60242ES03/10 | 1/10MU |