Apoptosis thường đề cập đến một loại chết tế bào được lập trình xảy ra thông qua sự điều chỉnh các gen nội bào và các sản phẩm của chúng trong quá trình phát triển của tế bào hoặc dưới tác động của một số yếu tố. Apoptosis đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển phôi và hình thái, sự ổn định của quần thể tế bào bình thường trong mô, khả năng phòng vệ và phản ứng miễn dịch của cơ thể, tổn thương tế bào và lão hóa do bệnh tật hoặc ngộ độc, sự xuất hiện và tiến triển của khối u và có ý nghĩa điều trị tiềm tàng.

Các sự kiện trong con đường apoptosis xảy ra theo trình tự thời gian, nghĩa là các sự kiện xảy ra theo trình tự và cuối cùng dẫn đến sự xuất hiện của các thể apoptosis, dẫn đến sự chết rụng tế bào.

Các đặc điểm điển hình của nó như sau:

1. Quá trình apoptosis sớm: thay đổi cấu trúc màng tế bào, đảo ngược phosphatidylserine;

2. Giai đoạn apoptosis sớm và giữa: mật độ tế bào chất tăng lên, điện thế màng ty thể biến mất, tính thấm thay đổi và cytochrome C được giải phóng vào tế bào chất;

3. Quá trình apoptosis muộn: truyền tín hiệu apoptosis;

4. Apoptosis muộn: DNA bị phân hủy thành đoạn có kích thước 180~200bp.

Hình 1: Sự xuất hiện và phát hiện các sự kiện tuần tự trong con đường apoptosis

1. Apoptosis sớm: Annexin-V/PI nhuộm kép (phát hiện PS trên màng ngoại bào)

Trong các tế bào sống bình thường, phosphatidylserine (PS) nằm ở mặt trong của màng tế bào. Khi apoptosis xảy ra, màng tế bào thay đổi và PS lật từ bề mặt bên trong của màng tế bào ra bề mặt bên ngoài của màng tế bào. Annexin-V là một protein liên kết phospholipid phụ thuộc Ca2+ có trọng lượng phân tử là 35-36 KD, có thể liên kết với PS với ái lực cao. Sử dụng Annexin-V được gắn nhãn bằng fluorescein (FITC, Alexa fluor488, v.v.) làm đầu dò, các tế bào apoptosis và tế bào sống có thể được xác định bằng phương pháp đo lưu lượng tế bào hoặc kính hiển vi huỳnh quang.

PS của tế bào hoại tử cũng sẽ chuyển từ bề mặt bên trong của màng tế bào sang bề mặt bên ngoài của màng tế bào. Annexin-V cũng có thể nhận ra PS trên bề mặt của tế bào hoại tử, vì vậy Annexin-V không thể phân biệt tế bào hoại tử với tế bào chết theo chương trình. Ngoài ra, propidine iodide (PI) là thuốc nhuộm axit nucleic, có thể liên kết với DNA trong tế bào và không thể xuyên qua màng tế bào hoàn chỉnh. Màng tế bào của tế bào chết theo chương trình sớm và tế bào sống vẫn còn nguyên vẹn và thuốc nhuộm PI không thể tự do xâm nhập vào tế bào thông qua màng tế bào để liên kết với DNA, vì vậy thuốc nhuộm PI không thể gắn nhãn tế bào chết theo chương trình và tế bào sống, nhưng thuốc nhuộm PI có thể liên kết với DNA trong tế bào thông qua màng tế bào của tế bào hoại tử. Thuốc nhuộm PI trong tế bào chết sẽ phát ra huỳnh quang màu đỏ sau khi được kích thích bằng tia laser 488nm và sẽ được kênh tương ứng tiếp nhận. Do đó, Annexin V và PI có thể được sử dụng cùng nhau để phân biệt tế bào sống, tế bào chết theo chương trình sớm và tế bào hoại tử.

Hình 2: Phân tích kết quả đo lưu lượng tế bào sau khi nhuộm đôi annexin-v/pi

Đặt hàng sản phẩm:

2. Apoptosis sớm: nhuộm JC-1 (phát hiện những thay đổi tiềm năng màng ty thể)

Quá trình apoptosis thường đi kèm với sự phá hủy tiềm năng xuyên màng ty thể, được coi rộng rãi là một trong những sự kiện sớm nhất trong quá trình apoptosis chuỗi. Nó xảy ra trước khi xuất hiện các đặc điểm của apoptosis nhân (nồng độ chromatin, đứt gãy DNA). Một khi tiềm năng xuyên màng ty thể sụp đổ, apoptosis tế bào là không thể đảo ngược. Sự tồn tại của tiềm năng xuyên màng ty thể cho phép một số thuốc nhuộm huỳnh quang cation ưa béo như rhodamine 123, JC-1, JC-10 liên kết với ma trận ty thể. Sự tăng hoặc giảm huỳnh quang của chúng chỉ ra sự tăng hoặc giảm độ âm điện của màng trong ty thể.

JC-1 được sử dụng rộng rãi để phát hiện điện thế màng ty thể △ΨM, cho thấy sự tích tụ phụ thuộc vào điện thế trong ty thể. Trong ty thể bình thường, JC-1 tập hợp trong ma trận ty thể để tạo thành một loại polyme phát ra huỳnh quang màu đỏ mạnh (ví dụ = 585 nm, em = 590 nm); Trong tế bào chết theo chương trình, điện thế xuyên màng ty thể bị khử cực, JC-1 được giải phóng khỏi ty thể, nồng độ giảm và đảo ngược thành dạng monome phát ra huỳnh quang màu xanh lá cây. Do đó, sự thay đổi màu sắc phản ánh trực tiếp sự thay đổi điện thế màng ty thể. Mức độ khử cực ty thể cũng có thể được đo bằng tỷ lệ cường độ huỳnh quang đỏ/xanh lục. Phát hiện JC-1 là một phương pháp phổ biến.

3. Apoptosis muộn: Phương pháp TUNEL (phương pháp đánh dấu đoạn DNA tại chỗ)

Ở giai đoạn cuối của quá trình apoptosis, một số lượng lớn các đầu 3-OH dính được tạo ra do sự đứt gãy chuỗi đôi hoặc đứt gãy chuỗi đơn của DNA nhiễm sắc thể. Dưới tác động của deoxyribonucleotide terminal transferase (TdT), dUTP được gắn nhãn luciferase có thể liên kết với đầu 3 của DNA, do đó có thể phát hiện các tế bào chết theo chương trình, các phương pháp như vậy được gọi là đánh dấu đầu nick dUTP trung gian bởi terminal deoxynucleotidyl transferase (TUNEL). Bởi vì các tế bào bình thường hoặc đang tăng sinh hầu như không có đứt gãy DNA, nên không có sự hình thành 3-OH và một số ít có thể được nhuộm màu. TUNEL thực sự là một phương pháp nghiên cứu kết hợp giữa sinh học phân tử và hình thái học. Nhuộm tại chỗ một nhân chết theo chương trình hoàn chỉnh hoặc thể chết theo chương trình có thể phản ánh chính xác các đặc điểm sinh hóa và hình thái điển hình của quá trình chết theo chương trình. Có thể dùng để xác định hình thái tế bào của các lát cắt mô nhúng parafin, lát cắt mô đông lạnh, tế bào nuôi cấy và tế bào phân lập từ mô, có thể phát hiện một số lượng rất nhỏ tế bào chết theo chương trình. Do đó, nó được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu về quá trình chết theo chương trình.

Sản phẩm liên quan: