Về T4 DNA Ligase
Tuy nhiên, T4 DNA Ligase vẫn phải đối mặt với một số thách thức trong các ứng dụng thực tế, bao gồm độ ổn định kém, liên kết bộ chuyển đổi-bộ chuyển đổi cao hoặc năng suất thư viện DNA thấp. Những vấn đề này có thể dẫn đến hiệu quả thử nghiệm giảm, chất lượng dữ liệu giảm, khả năng lặp lại kém của kết quả thử nghiệm và độ tinh khiết sản phẩm thấp, do đó ảnh hưởng đến hiệu quả chung của các thí nghiệm sinh học phân tử và độ chính xác của dữ liệu giải trình tự. Để giải quyết những vấn đề này, Yeasen, dựa trên ZymeEditor sáng tạo của công ty con Molefuture™ Nền tảng tiến hóa enzyme đã tiến hành tiến hóa enzyme trên DNA ligase T4.
Hình 1 Sơ đồ nguyên lý phản ứng của T4 DNA Ligase[1]
Sàng lọc thử nghiệm ướt và khô lặp đi lặp lại để có được T4 DNA Ligase hiệu suất cao
T4 DNA ligase, một enzyme ligase phụ thuộc ATP, bao gồm một miền liên kết DNA xoắn chặt (DBD), một miền nucleotidyl-transferase (NTase) và một miền OB-fold. Dựa trên cấu trúc protein, Yeasen'S đội phân tích các chất cặn bã trải dài khoảng cách từ 5 đến 20Å xung quanh chất nền DNA, sau đó sàng lọc in silico và phân tích cấu trúc-chức năng bằng các công cụ tính toán tiên tiến. Trong quá trình này, nhóm quan sát một vòng lặp linh hoạt nằm xa túi hoạt động. Được hướng dẫn bởi các tính toán năng lượng, nhóm thiết kế các phần cắt cụt trong vùng vòng lặp này, đưa ra giả thuyết rằng nó có thể không ảnh hưởng đáng kể đến chức năng thắt nhưng có thể ảnh hưởng đến độ ổn định cấu trúc tổng thể. Hơn nữa, nhóm trình tự đồng thuận được căn chỉnh để thiết kế các đột biến, kết hợp phân tích này với các cân nhắc về cấu trúc-chức năng, như minh họa trong hình bên dưới.
Hình 2 Cấu trúc của T4 DNA Ligase
Bên cạnh thiết kế hợp lý, sự tiến hóa có định hướng của T4 DNA ligase được tiến hành bằng phương pháp MTPS bằng cách sàng lọc tính ổn định, hoạt động và hoạt động còn lại. Và một thư viện gồm hơn 104 các đột biến đã được sàng lọc. Sau khi phân tích kỹ lưỡng dữ liệu đột biến, các ứng viên triển vọng đã được chọn để tinh chế và thử nghiệm nghiêm ngặt. Sau đó, tất cả những người chiến thắng thu được bằng thiết kế hợp lý và tiến hóa có định hướng đã được trải qua quá trình đặc tính hóa chi tiết sau khi tinh chế tinh chế, bao gồm các đánh giá về hoạt động, độ ổn định, tự thắt bộ điều hợp, tự thắt đoạn DNA và năng suất DNA. Dựa trên các đột biến G1, nhóm nghiên cứu tiến hành xáo trộn DNA và kết hợp thiết kế đột biến có định hướng để tạo ra các đột biến đặc biệt đáp ứng nhiều yêu cầu ứng dụng khác nhau.
Từ đột biến đến sản phẩm thị trường với nhiều vòng xác nhận trình tự
Các Biên tập viên ZymeTM Nền tảng tiến hóa enzyme đã tiến hóa thành công một đột biến DNA ligase T4 có độ ổn định nhiệt cao, năng suất thư viện cao và khả năng tự liên kết bộ điều hợp thấp thông qua công nghệ tiến hóa enzyme. T4 DNA Ligase cải tiến hiện tại đã được ra mắt thành công - Hieff® Versatile T4 DNA Ligase (600 U/μL) (Cat#12996ES). Sản phẩm này vượt trội hơn T4 DNA Ligase loại hoang dã truyền thống về hiệu quả gắn kết và độ ổn định nhiệt, và đã được xác minh bằng giải trình tự thông lượng cao, đảm bảo chất lượng tuyệt vời.
Trình bày dữ liệu
1. Độ ổn định nhiệt cao hơn
Các đột biến T4 DNA Ligase từ Yeasen đã được xử lý nhiệt ở 42℃ trong 0, 2 và 4 giờ, và được so sánh với T4 DNA Ligase từ Nhà cung cấp Q, N, A và T.Sau đó, một thư viện DNA toàn bộ bộ gen đã được xây dựng bằng cách sử dụng 1 µg gDNA bò bị phân mảnh với Yeasen Bộ dụng cụ xây dựng thư viện DNA (Mã số: 12927ES) để so sánh độ ổn định nhiệt của T4 DNA Ligase.
Hình 3 Kiểm tra độ ổn định nhiệt ở 42℃
Kết quả:
Độ ổn định nhiệt: Yeasen ≈ Nhà cung cấp N ≈ Nhà cung cấp A > Nhà cung cấp T > Nhà cung cấp Q.
2. Năng suất thư viện cao hơn
Đột biến T4 DNA Ligase từ Yeasen đã được thử nghiệm về năng suất thư viện ở cả mức đầu vào DNA cao và thấp, so với T4 DNA Ligases từ Nhà cung cấp Q, N, A và T. Yeasen Bộ dụng cụ xây dựng thư viện DNA (Mã số: 12927ES) được sử dụng, với 1 µg và 0,5 ng gDNA bò bị phân mảnh được đưa vào để xây dựng thư viện DNA.
Hình 4 Phân tích năng suất thư viện DNA
Kết quả:
Năng suất thư viện (1 µg gDNA): Yeasen > Nhà cung cấp Q ≈ Nhà cung cấp T ≈ Nhà cung cấp A > Nhà cung cấp N. Sản lượng thư viện (0,5 µg gDNA): Yeasen ≈ Nhà cung cấp Q ≈ Nhà cung cấp A ≈ Nhà cung cấp T > Nhà cung cấp N.
3. Tự thắt bộ chuyển đổi dưới
Đột biến T4 DNA Ligase từ Yeasen đã được so sánh với T4 DNA Ligases từ Nhà cung cấp Q, N, A và T để tự liên kết bộ điều hợp. Yeasen Bộ dụng cụ xây dựng thư viện DNA (Cat#12927ES) đã được sử dụng, với 0 ng và 0,5 ng gDNA bò bị phân mảnh được đưa vào để xây dựng thư viện DNA toàn bộ hệ gen.
Hình 5 Dữ liệu tự thắt của bộ điều hợp với đầu vào gDNA 0 ng (trái) và 0,5 ng (phải)
Kết quả:
1) Tỷ lệ tự thắt bộ điều hợp (0 ng gDNA): Nhà cung cấp N > Yeasen > Nhà cung cấp T > Nhà cung cấp A > Nhà cung cấp Q.
2) Tỷ lệ tự thắt bộ điều hợp (0,5 ng gDNA): Yeasen > Nhà cung cấp T > Nhà cung cấp Q ≈ Nhà cung cấp N > Nhà cung cấp A.
Liên hệ với chúng tôi
Yeasen đã thành công trong việc khắc phục những hạn chế của T4 DNA ligase truyền thống, cung cấp một sản phẩm T4 DNA ligase vượt trội về độ ổn định nhiệt, năng suất thư viện và khả năng tự liên kết của bộ điều hợp. Trong quá trình này, công ty đã tích lũy được một thư viện đột biến phong phú, cung cấp cho các nhà nghiên cứu nhiều lựa chọn để đáp ứng các nhu cầu thử nghiệm khác nhau. Nếu bạn quan tâm đến sản phẩm hoặc đột biến T4 DNA ligase của chúng tôi, vui lòng liên hệ với chúng tôi qua các phương pháp sau. E-mail: order1@yeasen.com (CHÚNG TA)
Điện thoại: +1 240-472-6069 (Mỹ)
Ngoài ra, Yeasen cung cấp một loạt các sản phẩm T4 DNA ligase. Nhấp vào liên kết sản phẩm để yêu cầu thông tin sản phẩm
Yeasen Dòng sản phẩm T4 DNA Ligase
| định vị sản phẩm | Tên sản phẩm | Mèo số. |
| Độ ổn định nhiệt cao và tỷ lệ tự thắt thấp | Hieff® T4 DNA Ligase đa năng (600 U/μL) | 12996ES |
| Thắt nút nhanh chóng và hiệu quả, ít cặn, hoàn toàn phù hợp cho nhu cầu phát hiện mầm bệnh. | T4 DNA Ligase nhanh (400 U/µL) | 10299ES |
| mô hình phổ quát | T4 DNA Ligase nhanh (400 U/µL) | 10301ES |
Tài liệu tham khảo
[1] Shuman S .DNA Ligases: Tiến trình và triển vọng[J].Tạp chí Hóa học sinh học, 2009, 284(26):17365-17369.
