RNase HII, còn được gọi là RNase H2, là một endoribonuclease nhắm mục tiêu cụ thể và cắt đứt liên kết phosphodiester ở đầu 5' của một ribonucleotide đơn lẻ nằm trong chuỗi xoắn kép DNA, tạo ra nhóm phosphate 5' và nhóm hydroxyl 3' (Hình 1). Enzym này thể hiện hoạt động cắt tối thiểu đối với RNA sợi đơn và không hoạt động đối với cả DNA sợi đôi (dsDNA) và DNA sợi đơn (ssDNA). Hoạt động chức năng trong phạm vi nhiệt độ từ 50°C đến 75°C, RNase HII đạt hiệu suất cao nhất ở nhiệt độ từ 70°C đến 75°C. Tận dụng khả năng độc đáo của nó để thực hiện cắt mục tiêu, cắt tại một vị trí tại các vị trí DNA nơi ribonucleotide được tích hợp, mà không ảnh hưởng đến dsDNA hoặc ssDNA, RNase HII đóng vai trò là "chất kích hoạt" chính xác để bắt đầu phản ứng, bao gồm kích hoạt và kéo dài mồi, để đạt được sự khuếch đại đặc hiệu. Enzym này đóng vai trò quan trọng trong phản ứng PCR phụ thuộc RNase H (rhPCR), công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt qua vòng (LAMP) và quá trình phân hủy các thành phần RNA trong các đoạn Okazaki.

1. PCR phụ thuộc RNase H(rhPCR)
rhPCR kết hợp RNase HII và các đoạn mồi rhPCR đóng có thể cắt được được thiết kế đặc biệt vào quy trình PCR. Phương pháp này tận dụng đặc tính độc đáo của RNase HII để thủy phân RNA một cách chọn lọc trong các lai DNA-RNA, đồng thời giữ nguyên các liên kết phosphodiester trong DNA và RNA mạch đơn hoặc mạch đôi. Do đó, RNase HII chỉ tiêu hóa lai DNA-RNA và cho phép kéo dài đoạn mồi khi đoạn mồi bổ sung hoàn hảo với trình tự DNA mục tiêu. Hành động nhắm mục tiêu này làm tăng đáng kể độ chính xác của phản ứng. RNase HII là enzyme duy nhất có khả năng bắt đầu loại bỏ chính xác các ribonucleotide mà không gây ra đột biến bằng cách cắt ở đầu 5' của axit ribonucleic. Do tính đặc hiệu, độ nhạy và khả năng tái tạo cao, rhPCR mang lại những lợi thế riêng biệt trong các ứng dụng như phát hiện đa hình nucleotide đơn (SNP), phân loại gen, phát hiện đồng thời nhiều mục tiêu và phân tích axit nucleic môi trường.

Tuyến đường kỹ thuật

1. Thiết kế mồi

Thiết kế mồi phải đảm bảo nhiệt độ nóng chảy sau khi cắt cao hơn nhiệt độ ủ để đảm bảo mồi liên kết ổn định với khuôn mẫu trong các chu kỳ PCR. Mồi rhPCR bao gồm ba phần:

1) Đoạn DNA 5': Có độ dài và nhiệt độ nóng chảy (Tm) tương đương với các đoạn mồi PCR tiêu chuẩn, có thể ghép nối và kéo dài hiệu quả từ DNA khuôn mẫu sau khi bị cắt bởi enzyme RNase HII.

2）Một bazơ RNA đơn: cung cấp vị trí cắt cho RNase HII.

3) Đoạn DNA 3': Một đoạn dài bốn hoặc năm bazơ có chất chặn, thường là một phân tử ngắn, không thể kéo dài như propylene glycol, có tác dụng ngăn cản sự kéo dài của DNA polymerase cho đến khi chất chặn được loại bỏ.

2. Cắt và nối dài

Khi bắt đầu phản ứng rhPCR, đoạn mồi và DNA khuôn mẫu được giải phóng. Khi đoạn mồi liên kết với khuôn mẫu RNA:DNA heteroduplex cụ thể, cạnh 5' của RNA base của đoạn mồi bị chặn được nhận diện và cắt bởi enzyme RNase HII, để lại một oligonucleotide DNA với nhóm 3'-hydroxyl, cung cấp điểm khởi đầu cho DNA polymerase mở rộng. Tiếp theo là quá trình khuếch đại PCR thông thường.

Hình 2. Sơ đồ nguyên lý rhPCR ^[1]

Thứ hai.Khuếch đại đẳng nhiệt qua vòng lặp (LAMP)

Khuếch đại đẳng nhiệt qua vòng lặp (LAMP) là một phương pháp khuếch đại gen đơn giản và nhanh chóng có thể khuếch đại axit nucleic trong điều kiện đẳng nhiệt trong thời gian ngắn. Tuy nhiên, do hoạt động của DNA polymerase bắt đầu trong quá trình chuẩn bị ở nhiệt độ phòng, các sự không khớp không đặc hiệu được hình thành, có thể dẫn đến một lượng nhỏ sự ghép cặp sai và các cặp mồi, gây ra các tạp chất nhỏ có thể dẫn đến kết quả dương tính giả.
Áp dụng RNase HII vào hệ thống khuếch đại LAMP có thể giải quyết hiệu quả vấn đề dương tính giả trong công nghệ LAMP, mở rộng ứng dụng của nó trong chẩn đoán lâm sàng. Như thể hiện trong Hình 3, phương pháp LAMP được kích hoạt bằng mồi (PA-LAMP) sử dụng RNase HII, khi mồi ghép cặp với ssDNA mục tiêu, enzyme RNase HII sẽ cắt RNA trên mồi một cách đặc hiệu, kích hoạt nó và cho phép mồi kéo dài, đạt được sự khuếch đại đặc hiệu và giảm hiệu quả các dương tính giả trong hệ thống.

Yeasen RNase HII

YeasenRNase HII của 's (Mã số mèo 14539) được bắt nguồn từ Pyrococcus abyssi, Pavà không chứa các nuclease, enzyme cắt và dư lượng RNase gây ô nhiễm, với mức độ ô nhiễm DNA vật chủ thấp, giúp giảm hiệu quả các kết quả dương tính giả trong hệ thống. YeasenRNase HII có khả năng chịu nhiệt cực tốt, duy trì hoạt động ngay cả sau 30 phút ở nhiệt độ 95°C, khiến nó tương thích với nhiều hệ thống phản ứng rhPCR khác nhau và cũng phù hợp với LAMP và các ứng dụng khác.

1. E. coli dư lượng DNA bộ gen < 0,5 bản sao/100 U

Phát hiện Vi khuẩn E. coli phần còn lại của DNA bộ gen trong các lô RNase HII khác nhau cho thấy phần còn lại của DNA bộ gen vật chủ YeasenRNase HII của 's thấp hơn nhiều so với 0,5 bản sao/100 U.

Hình 4. Phát hiện Vi khuẩn E. coli dư lượng DNA bộ gen

2. Kiểm tra khả năng chịu nhiệt 95°C

Sau khi đun nóng RNase HII ở 95°C trong 0 đến 45 phút, hoạt động của enzyme RNase HII đã được thử nghiệm. Kết quả cho thấy hầu như không có sự mất hoạt động của enzyme trong YeasenRNase HII vẫn hoạt động ngay cả sau 45 phút đun nóng.

Hình 5. Thử nghiệm khả năng chịu nhiệt 95°C

3. Không có Exonuclease, Enzym cắt, hoặc Dư lượng RNase (Liều 1 U)

Khi ủ 1 U các lô RNase HII khác nhau với các chất nền DNA/RNA tương ứng của chúng ở 37°C trong 4 giờ, kết quả điện di trên gel agarose cho thấy không có exonuclease, enzyme cắt hoặc dư lượng RNase trong RNase HII.

Hình 6.Kết quả phát hiện exonuclease, enzyme cắt và dư lượng RNase

Sản phẩm liên quan được đề xuất

Ứng dụng sản phẩm	Tên sản phẩm	Số danh mục
rhPCR, LAMP	RNase HII (2 U/μL) RNase HII, không chứa Glycerol (2 U/μL)	14539ES 14541ES
rhPCR	DNA Polymerase Hieff® Taq	10101ES
ĐÈN RT	Hieff® Bst Plus DNA Polymerase (40 U/μL)	14402ES
	Phiên mã ngược Hifair® Ⅲ	11111ES

Tài liệu tham khảo

[1] Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA. PCR phụ thuộc vào RNase H (rhPCR): cải thiện độ đặc hiệu và phát hiện đa hình nucleotide đơn bằng cách sử dụng các đoạn mồi có thể cắt bị chặn. BMC Biotechnol. 2011 ngày 10 tháng 8; 11: 80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80.

[2] Du WF , Ge JH , Li JJ , et al. Phát hiện đột biến nucleotide đơn, độ đặc hiệu cao bằng khuếch đại đẳng nhiệt trung gian vòng lặp có thể kích hoạt bằng mồi (PA-LAMP)[J].Analytica chimica acta, 2019(1050-):1050.DOI:10.1016/j.aca.2018.10.068.