Hình 1. Sơ đồ phân cắt dsDNA của DNase I khi có mặt Mg²⁺ và Mn²⁺

DNase I thông thường chủ yếu được tinh chế từ tuyến tụy bò hoặc là một loại enzyme tái tổ hợp. So với DNase I được tinh chế từ tuyến tụy bò, DNase I tái tổ hợp có mức RNase nội sinh tương đối thấp hơn hoặc có thể được bào chế thành các sản phẩm không chứa RNase, khiến nó phù hợp hơn cho các ứng dụng nhạy cảm với RNase, chẳng hạn như loại bỏ DNA khỏi các mẫu RNA.

Ứng dụng

Về ứng dụng, DNase I nổi tiếng vì được sử dụng trong các thí nghiệm liên quan đến việc duy trì tính toàn vẹn của RNA, chẳng hạn như chiết xuất RNA không có DNA, chuẩn bị khuôn mẫu RNA không có gDNA trước khi phiên mã ngược và phân hủy khuôn mẫu DNA sau khi phiên mã trong ống nghiệm. Ngoài ra, nó có thể được sử dụng để tiêu hóa các đầu dò DNA trong quá trình loại bỏ rRNA, để gắn nhãn DNA thông qua dịch mã nick, phân tích tương tác DNA-protein bằng phương pháp dấu chân, tạo thư viện DNA ngẫu nhiên, giảm độ nhớt của dịch phân hủy tế bào hoặc chiết xuất protein, tiêu hóa các chất kết dính tế bào như một chất phụ gia trong nuôi cấy tế bào và cắt một phần DNA bộ gen như một đối chứng dương tính trong xét nghiệm TUNEL để phát hiện apoptosis. Tóm lại, DNase I có thể được sử dụng trong hầu hết mọi ứng dụng yêu cầu tiêu hóa DNA bằng enzyme. Dưới đây, chúng tôi sẽ giới thiệu ngắn gọn về một số ứng dụng phổ biến.

• Loại bỏ gDNA trước khi chiết xuất RNA hoặc phiên mã ngược

RNA, là một mẫu thường được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng dữ liệu thực nghiệm do chất lượng của chính nó. Nhìn chung, không thể tránh hoàn toàn phần gDNA còn sót lại trong quá trình chiết xuất RNA. Do đó, trước khi tiến hành các ứng dụng hạ nguồn đầy thách thức (như phân tích biểu hiện mRNA, phân tích phiên mã, v.v.), người ta thường khuyến nghị xử lý các mẫu RNA bằng DNase I để tiêu hóa phần gDNA còn sót lại. Quá trình tiêu hóa gDNA có thể được thực hiện trong quá trình chiết xuất RNA, sau khi chiết xuất RNA hoặc trước khi phiên mã ngược RNA.

Hình 2. Quy trình loại bỏ gDNA dựa trên DNase I

• Loại bỏ DNA khuôn mẫu trong phiên mã trong ống nghiệm

Phiên mã trong ống nghiệm (IVT) chủ yếu sử dụng DNA làm khuôn mẫu để sản xuất RNA dưới tác động của các chất nền và chất đệm thích hợp. Các RNA polymerase thường được sử dụng trong quá trình này bao gồm T7, T3 và SP6, có chức năng xúc tác tổng hợp RNA. Tuy nhiên, sản phẩm RNA tổng hợp có thể chứa các gốc DNA và việc loại bỏ các gốc này có lợi cho các thí nghiệm tiếp theo.

Đặc biệt trong quá trình phát triển vắc-xin mRNA, việc loại bỏ các dư lượng DNA này là một bước quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến độ khó của các quá trình tinh chế tiếp theo và độ tinh khiết của sản phẩm cuối cùng.Để loại bỏ hiệu quả DNA khuôn mẫu, DNase I thường được sử dụng để xử lý nhằm đảm bảo mẫu RNA không còn dư lượng DNA, một bước giúp cải thiện độ chính xác và hiệu quả tổng thể của thí nghiệm.

Hình 3: Quá trình phiên mã trong ống nghiệm sử dụng plasmid tuyến tính làm khuôn mẫu^[4]

• Loại bỏ rRNA trong quá trình xây dựng và giải trình tự thư viện RNA

Trong các sinh vật, rRNA rất phong phú và được bảo tồn cao, điều này không có ý nghĩa nhiều đối với việc thu thập thông tin sinh học trong nghiên cứu. Tuy nhiên, 95% tổng số RNA được chiết xuất trong các thí nghiệm là rRNA của con người và sự hiện diện của các rRNA này có thể gây trở ngại cho việc phát hiện các RNA mục tiêu. Do đó, trong quá trình chuẩn bị và giải trình tự thư viện RNA, rRNA thường được loại bỏ trước. Hiện nay, phương pháp chính để loại bỏ rRNA là tiêu hóa RNAase và hoạt động chính của nó các bước và nguyên tắc như sau:

1. Chiết xuất tổng RNA;
2. Lai các đầu dò DNA mạch đơn với các phân tử rRNA (Lưu ý: Thiết kế và tổng hợp các đầu dò DNA mạch đơn đặc hiệu rRNA);
3. RNase H phân hủy rRNA lai;
4. DNase I phân hủy các đầu dò DNA;
5. rRNA được loại bỏ thành công, để lại khuôn mẫu RNA không phải rRNA.

Hình 4: Sơ đồ nguyên lý loại bỏ rRNA dựa trên phương pháp enzym^[5]

• Nick dịch cho nhãn DNA

Bản dịch Nick là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để dán nhãn các đầu dò axit deoxyribonucleic trong phòng thí nghiệm. Phương pháp này đạt được thông qua hoạt động kết hợp của DNase I và Vi khuẩn E.coli ADN Polymerase I.

Nguyên tắc chính như sau:

1. Đầu tiên, sử dụng nồng độ DNase I thích hợp để tạo ra một số vết cắt đơn trên mỗi sợi của DNA sợi đôi cần dán nhãn, tạo thành đầu hydroxyl 3' tại các vị trí cắt.
2. Sau đó, sử dụng hoạt động exonuclease 5'→3' của vi khuẩnDNA Polymerase I để loại bỏ một nucleotide từ đầu 5' của vết khía, trong khi hoạt động polymerase 5'→3' của E. vi khuẩn DNA Polymerase I đưa một nucleotide được gắn nhãn vào đầu 3' của vết cắt để sửa chữa nó. Khi vết cắt di chuyển dọc theo chuỗi DNA, các nucleotide được gắn nhãn được đưa vào chuỗi DNA mới tổng hợp.

Hình 5: Sơ đồ nguyên lý của phương pháp đánh dấu DNA bằng cách dịch mã nick^[6]

• Thí nghiệm đánh giá dấu chân DNase I

Xét nghiệm dấu chân DNase I là một phương pháp chính xác để xác định các vị trí liên kết của protein liên kết DNA trên các phân tử DNA. Nguyên tắc là các protein liên kết với một đoạn DNA bảo vệ vùng liên kết khỏi bị phân hủy bởi DNase I. Sau khi tiêu hóa bằng enzym, đoạn còn lại ("dấu chân") có thể được sử dụng để xác định trình tự của nó. Trong hình ảnh gel, không có dải nào tương ứng với các vùng mà protein được liên kết.

Nguyên tắc chính như sau:

1. Đánh dấu các đầu sợi đơn của phân tử DNA sợi đôi cần thử nghiệm.
2. Trộn protein với DNA và thêm một lượng DNase I thích hợp để tiêu hóa bằng enzym, tạo thành các đoạn DNA có độ dài khác nhau.Lượng enzyme phải được kiểm soát để đảm bảo các đoạn DNA liền kề chỉ khác nhau một nucleotide và phải đưa vào song song một mẫu đối chứng không có protein bổ sung.
3. Loại bỏ protein khỏi DNA, tách DNA biến tính bằng điện di PAGE và chụp ảnh tự động để giải thích trình tự nucleotide của vùng dấu chân bằng cách so sánh với nhóm đối chứng.

Hình 6: Sơ đồ nguyên lý của phép thử dấu chân DNase I^[7]

Các DNase I Hướng dẫn lựa chọn của Yeasen

Để đáp ứng các nhu cầu ứng dụng khác nhau, Yeasen cung cấp tái tổ hợp DNase I TRONG Vi khuẩn E. colivà có thể cung cấp DNase I đạt chuẩn GMP để đáp ứng các yêu cầu của phiên mã mRNA trong ống nghiệm và các ứng dụng khác.

Vị trí sản phẩm	Ứng dụng	Tên sản phẩm	số danh mục
Không có RNase	loại bỏ DNA khỏi RNA và chế phẩm protein	DNase I tái tổ hợp (không có RNase)	10325ES
Đạt tiêu chuẩn GMP, Không có RNase	Phiên mã mRNA trong ống nghiệm	UCF.ME® Deoxyribonuclease I (DNase I) đạt chuẩn GMP	10611ES

Tài liệu tham khảo

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L, et al. Phát hiện DNA HPV, mRNA E6/E7 và p16INK4a trong ung thư đầu và cổ: tổng quan hệ thống và phân tích tổng hợp[J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.

[2] Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, et al. So sánh tải lượng DNA virus đặc hiệu loại HPV gây ung thư và phát hiện mRNA E6/E7 trong các mẫu cổ tử cung: kết quả từ một nghiên cứu đa trung tâm[J]. Tạp chí virus học y khoa, 2013, 85(3): 472-482.

[3] Huang Z, Fasco MJ, Kaminsky L S. Tối ưu hóa quá trình loại bỏ DNA nhiễm bẩn khỏi RNA bằng Dnase I để sử dụng trong RNA-PCR định lượng[J]. Biotechniques, 1996, 20(6): 1012-1020.

[4] Kang DD, Li H, Dong Y. Những tiến bộ của mRNA phiên mã trong ống nghiệm (IVT mRNA) để cho phép dịch mã vào các phòng khám[J]. Đánh giá phân phối thuốc tiên tiến, 2023, 199: 114961.

[5] Wiame I, Remy S, Swennen R, et al. Sự bất hoạt nhiệt không thể đảo ngược của DNase I mà không làm suy thoái RNA[J]. Biotechniques, 2000, 29(2): 252-256.

[6] Adolph S, Hameister H. Bản dịch nick tại chỗ của nhiễm sắc thể kỳ giữa với d-UTP được gắn nhãn biotin[J]. Di truyền học con người, 1985, 69: 117-121.

[7] Song C, Zhang S, Huang H. Chọn phương pháp thích hợp để xác định nguồn gốc sao chép trong bộ gen vi khuẩn. Front Microbiol, 2015, 6: 1049.