Với sự phát triển nhanh chóng của glycoproteomics và nghiên cứu thuốc kháng thể, sự biến đổi glycosyl hóa cũng thu hút được nhiều sự chú ý. Sự tiếp xúc giữa các tế bào với nhau, và giữa các tế bào với mầm bệnh chủ yếu được hoàn thành thông qua sự tương tác của đường và protein, và glycosyl hóa quyết định các đặc tính bám dính của glycoconjugate. Trong IgG, glycosyl hóa liên kết N được bảo tồn tại Asn297 trong vùng Fc cũng rất quan trọng đối với hoạt động của nó. Ngoài ra, một số kháng thể cũng có thêm N-glycan, cùng với vị trí bảo tồn tại Asn297 trong vùng Fc, ảnh hưởng đến khả năng nhận diện, thời gian bán hủy và phản ứng miễn dịch của kháng thể.
Glycosyl hóa protein là một biến đổi sau dịch mã phức tạp liên quan đến sự kết nối của các chuỗi glycan tại các vị trí cụ thể trên protein. Tùy thuộc vào loại chuỗi glycan, glycoprotein được chia thành glycoprotein liên kết N, glycoprotein liên kết O, v.v.; hơn nữa, glycosyl hóa protein cũng bị ảnh hưởng bởi loại tế bào chủ và điều kiện lên men (như môi trường nuôi cấy, giá trị pH, nhiệt độ, v.v.). Do đó, glycoprotein thường có tính không đồng nhất về kiểu glycosyl hóa, bao gồm các vị trí glycosyl hóa, mức độ glycosyl hóa và cấu trúc cụ thể của chuỗi glycan, khiến cho việc phân tích chuỗi glycan và đặc điểm cấu trúc trở nên cực kỳ khó khăn. Để thu được lượng thông tin về cấu trúc chuỗi glycan tối đa, chiến lược chính của phân tích chuỗi glycan là trước tiên giải phóng các chuỗi glycan khỏi protein và sau đó tiến hành phân tích và đặc điểm chi tiết. Trong chiến lược này, một phương pháp khử glycosyl hóa hiệu quả, chính xác và ổn định là rất quan trọng.
Phương pháp dùng enzym hiện đang được sử dụng rộng rãi để khử glycosyl.
Glycoprotein có thể được phân loại thành glycopeptide liên kết N và liên kết O dựa trên loại chuỗi glycan của chúng. Đối với glycopeptide liên kết N, các enzyme thường được sử dụng bao gồm peptide N-glycosidase F (PNGase F), endoglycosidase H (Endo H) và endoglycosidase S (Endo S). PNGase F thủy phân liên kết GlcNAc-Asn và có thể loại bỏ các chuỗi glycan phức hợp, mannose cao và lai. Endo H cắt các liên kết glycosidic bên trong lõi pentasaccarit chuỗi N-glycan. Endo S cắt cụ thể các glycan liên kết N từ lõi chitobiose của chuỗi nặng của IgG tự nhiên.
Hình 1. Vị trí cắt của PNGase F, Endo H và Endo S.
Trong số đó, PNGase F là phương pháp sử dụng enzym hiệu quả nhất để loại bỏ hầu hết các liên kết N oligosaccharides trong glycoprotein, có thể cắt các glycoprotein oligosaccharides phức hợp, lai và có hàm lượng mannose cao được kết nối bởi asparagine, đặc biệt loại bỏ các glycan liên kết N. Vị trí cắt là: liên kết amide giữa N-acetylglucosamine (GlcNAc) trong cùng và phần còn lại của asparagine, đồng thời chuyển đổi asparagine trên protein sau khi thủy phân bằng enzym thành axit aspartic.
Khi α1-6 fucose nằm ở lõi GlcNAc, PNGase F cũng có thể cắt; chỉ khi α1-3 fucose nằm ở lõi GlcNAc (thường gặp trong glycoprotein thực vật và côn trùng) thì PNGase F mới không thể cắt.
Tuy nhiên, phản ứng enzym PNGase F thông thường cần nhiều giờ để giải phóng kháng thể N-glycan và do ưu tiên giải phóng glycan, quá trình khử glycosyl hóa không hoàn toàn có thể dẫn đến kết quả sai lệch và phân bố glycan thu được có thể không biểu thị đúng thành phần của kháng thể điều trị. Do đó, việc thu được hồ sơ N-glycan chính xác càng nhanh càng tốt là rất quan trọng để theo dõi quá trình glycosyl hóa trong quá trình sản xuất kháng thể và protein hợp nhất kháng thể và các tác nhân sinh học điều trị khác.
PNGase F nhanh
Fast PNGase F là thuốc thử tái tổ hợp được tối ưu hóa có thể nhanh chóng và hoàn toàn loại bỏ glycosyl hóa kháng thể, immunoglobulin, protein tổng hợp và các glycoprotein khác trong vài phút. Enzym này có thể nhanh chóng và không có sở thích loại bỏ tất cả N-glycan và có thể được sử dụng trực tiếp cho phân tích sắc ký hạ lưu hoặc khối phổ.
Tính năng sản phẩm:
Nhanh: Quá trình khử glycosyl hóa hoàn toàn và nhanh chóng trong vài phút.
Độ tinh khiết cao: Không nhiễm protease, glycosidase, độ tinh khiết ≥95%.
Không chọn lọc: Nhanh chóng và không cần ưu tiên loại bỏ tất cả N-glycan.
Khả năng tương thích tốt: Được sử dụng trực tiếp cho phân tích sắc ký hạ lưu hoặc phổ khối.
Dữ liệu thử nghiệm:
Tách glycosyl protein một bước:
- 10 ug chất nền/100 ug kháng thể và ddH2O trộn đều thành tổng thể tích 16 uL;
- Thêm 4 μL đệm Fast PNGase F (5x), thể tích cuối cùng là 20 uL;
- Thêm 1 μL Fast PNGase F.
- Ủ ở nhiệt độ 50°C trong 10 phút.
Hình 2. Hiệu ứng cắt enzym một bước trên chất nền protein (A) và kháng thể (B).
1: Protein MarkerCat#20350ES) 2: Đối thủ cạnh tranh + chất nền hoặc kháng thể 3: Đối thủ cạnh tranh + chất nền hoặc kháng thể 4:
Quá trình khử glycosyl hóa protein hai bước:
- 10 ug chất nền/100 ug kháng thể và ddH2O trộn đều thành tổng thể tích 16 uL;
- Thêm 4 μL đệm Fast PNGase F (5x), thể tích cuối cùng là 20 uL;
- Ủ ở 80°C trong 2 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng.
- Thêm 1 μL Fast PNGase F.
- Ủ ở nhiệt độ 50°C trong 10 phút.
Hình 3. Hiệu ứng cắt enzyme hai bước trên chất nền protein (A) và kháng thể (B).
1: Protein MarkerCat#20350ES) 2: Đối thủ cạnh tranh + chất nền hoặc kháng thể 3: Đối thủ cạnh tranh + chất nền hoặc kháng thể 4:
Phần kết luận:
-
Yeasen Fast PNGase F có hiệu suất phân cắt bằng enzym tương đương hoặc cao hơn so với các đối thủ nhập khẩu trong cùng điều kiện phản ứng; - Nên thực hiện cắt enzym hai bước để đảm bảo hiệu quả cắt enzym cao hơn. Một số kháng thể (như Fab N-glycosyl hóa) cần bước làm nóng trước
để khử glycosyl hóa hiệu quả.
Ngoài ra,
Hướng dẫn mua hàng
| Sản phẩm màu nâu | 20406ES | 20407ES | 20414ES | 20413ES |
| Tên sản phẩm | Nhanh PNGase F | PNGase F | Nội tiết H | Nội tiết S |
| Nguồn | Biểu hiện tái tổ hợp của nấm men | Biểu hiện tái tổ hợp của nấm men | Biểu hiện tái tổ hợp của nấm men | Vi khuẩn E.coli biểu hiện tái tổ hợp |
| Hoạt động cụ thể | Không áp dụng | 100000U/mL | 1000000U/mL | 8000 U/mg |
| Vị trí phân cắt | Hầu như tất cả các glycan liên kết N | Hầu như tất cả các glycan liên kết N | Glycan mannose cao liên kết N | Tách trong cấu trúc disaccharide cốt lõi của chuỗi nặng IgG |
| Thời gian tiêu hóa | 10 phút | 1-3 giờ | 1-3 giờ | 1 giờ |
| Glycosyl hóa | Thích hợp | Thích hợp | Thích hợp | Thích hợp |
| Cấu trúc protein | Thích hợp | Thích hợp | Thích hợp | Thích hợp |
Thông tin đặt hàng
| Tên sản phẩm | Số sản phẩm | Đặc điểm kỹ thuật |
| 20406ES20/50 | 20 tấn/50 tấn | |
| 20407ES01/02 | 15000U/75000U | |
| 20414ES92/97 | 10000U/50000U | |
| 20413ES80/90 | 1000U/5 x 1000U |