Khi nói đến telomere và Protelomerase Trong sinh học, tâm trí con người thường nghĩ đến lão hóa đầu tiên, một hiện tượng tự nhiên không thể tránh khỏi. Telomere là trình tự DNA lặp lại ở cuối nhiễm sắc thể nhân chuẩn, mang trách nhiệm duy trì tính toàn vẹn của nhiễm sắc thể và điều chỉnh chu kỳ phân chia tế bào.
Protelomerase là một enzyme tổng hợp DNA phiên mã ngược kéo dài telomere. Nó là một nucleoprotein bao gồm RNA và protein. Thành phần protein có thể xúc tác quá trình tổng hợp các chuỗi lặp lại của telomere với thành phần RNA.
Hình 1. Cơ chế kéo dài Telomere qua trung gian Protelomerase[1]
Protelomerase có thể sửa chữa và kéo dài telomere, bù đắp cho các khiếm khuyết trong quá trình sao chép DNA, ngăn ngừa mất telomere trong quá trình phân chia tế bào và tăng số lượng phân chia tế bào. Năm 2009, Giải Nobel Sinh lý học hoặc Y học đã được trao cho Elizabeth H Blackburn, Carol W Greider và Jack W Szostak vì những đóng góp nổi bật của họ trong việc Tiết lộ vai trò quan trọng của telomere và Protelomerase trong chức năng tế bào và quá trình lão hóa.
Hôm nay, tôi muốn giới thiệu với các bạn một loại Protelomerase độc đáo: TelN proProtelomerase. TelN Protelomerase xuất phát từ vi khuẩn N15 và là thành phần của hệ thống sao chép N15, tham gia trong quá trình tạo ra DNA prophage tuyến tính. Không giống như Protelomerase ở sinh vật nhân chuẩn, TelN là một enzyme protein tinh khiết không có bất kỳ thành phần RNA nào. Nó có tính chất cắt-lắp hoạt động và để lại một đầu đóng cộng hóa trị tại vị trí cắt sau khi cắt DNA sợi đôi (dsDNA).
Hình 2. Protelomerase TelN Vị trí phân cắt
Protelomerase TelN Cơ chế hoạt động
Vị trí nhận dạng của TelN Protelomerase là một chuỗi palindrome dài 56 bp, với telR và telL ở cả hai bên. Vị trí trung tâm của chuỗi mục tiêu cũng là một chuỗi palindrome telO. TelN Protelomerase cắt trong chuỗi telO và tạo thành cấu trúc kẹp tóc đóng cộng hóa trị ở hai đầu cắt. Đầu cuối của DNA sau khi tiêu hóa vẫn bao gồm telR và telL, được gọi là xương chó ADN (dbDNA).
Hình 3. Protelomerase cơ chế phân cắt tại vị trí TelN[2]
Do hoạt động cắt-lắp đặc biệt của enzyme TelN Protelomerase, DNA plasmid dạng vòng có thể được chuyển đổi thành các phân tử hình quả tạ khép kín liên kết cộng hóa trị tuyến tính thông qua phản ứng enzyme một bước. So với các phân tử DNA mở tuyến tính, DNA đóng tuyến tính có mức biểu hiện protein cao hơn trong tế bào, rất phù hợp để xây dựng mini DNA khép kín tuyến tính có độ ổn định cao và trình tự ngoại lai tối thiểu. DNA plasmid đóng vai trò quan trọng như là thành phần cốt lõi của vắc-xin mRNA, vắc-xin DNA và liệu pháp gen tế bào. Phương pháp sản xuất plasmid truyền thống liên quan đến quá trình lên men với Vi khuẩn E. coli và khuếch đại nhiều giai đoạn, và rủi ro không thể kiểm soát trong quá trình lên men hạn chế sản lượng plasmid chất lượng cao, trở thành chìa khóa để hạn chế năng lực sản xuất vắc-xin. Công ty Touchlight tại Anh đã đưa ra công nghệ dbDNA cải tiến. Công nghệ này phá vỡ phương pháp lên men vi khuẩn truyền thống để chuẩn bị DNA plasmid và thay vào đó sử dụng tổng hợp DNA bằng enzym trong ống nghiệm. Hoạt động cắt-lắp ghép enzym đặc biệt của TelN Protelomerase cũng được sử dụng để tạo ra mini DNA đầu đóng tuyến tính theo phương pháp trên.
Ứng dụng của TelN Protelomerase trong tổng hợp enzyme DNA
Phương pháp enzyme DNA in vitro dựa trên DNA polymerase phi29 và TelN Protelomerase có thể tránh được nhiều rủi ro không kiểm soát được trong quá trình lên men sinh học, phương pháp enzyme in vitro có thể tổng hợp DNA với tốc độ nhanh và năng suất cao. DNA tổng hợp có thể được sử dụng trong nhiều công nghệ mới nổi, chẳng hạn như vắc-xin mRNA, vắc-xin DNA, vectơ liệu pháp gen và chỉnh sửa gen.
Hình 4. Sơ đồ tổng hợp enzyme DNA[3]
Quá trình tổng hợp DNA bằng enzyme
- Biến tính mẫu
Khuôn mẫu DNA plasmid dạng vòng được chuyển đổi thành hai DNA dạng vòng sợi đơn thông qua quá trình biến tính.
- Khuếch đại vòng tròn lăn
Sự khuếch đại vòng tròn lăn được thực hiện bằng cách sử dụng DNA polymerase Phi29 và DNA vòng sợi đơn để tạo ra DNA mạch đôi tuyến tính dài với các khoảng trình tự nhận dạng Protelomerase.
- Cắt và Đóng Cộng Hóa Trị
Protelomerase TelN nhận biết telRL trên DNA của phức hợp telomere và thực hiện các hoạt động cắt-gắn kết để tạo ra các monome DNA tuyến tính được kết nối cộng hóa trị.
- Loại bỏ DNA xương sống của vi khuẩn
Endonuclease hạn chế hoặc exonuclease phân hủy DNA bộ xương của vi khuẩn có cấu trúc mở ở cuối để thu được DNA chỉ chứa các yếu tố biểu hiện gen mục tiêu. Tổng hợp bằng enzyme của công nghệ DNA bỏ qua quá trình lên men sinh học và có thể nhanh chóng đạt được tổng hợp DNA plasmid cấp GMP, giải quyết các hạn chế về năng lực sản xuất trong lĩnh vực liệu pháp gen và vắc-xin mRNA. Nó có tiềm năng to lớn cho công nghiệp hóa. Để thúc đẩy sự phát triển của công nghệ tổng hợp bằng enzyme DNA,
Ptrình bày hiệu suất của
- Hiệu suất cắt-thắt rất tuyệt vời, tương đương với các thương hiệu nhập khẩu.
Sử dụng plasmid siêu xoắn chứa vị trí nhận dạng TelN Protelomerase làm khuôn mẫu, Enzym cộng gradient (0,078-5 U) từ
Hình 5. Phát hiện hoạt động cắt của Protelomerase của TelN M:Marker, C: kiểm soát plasmid siêu xoắn
- Độ toàn vẹn đóng của dsDNA tuyến tính > 90%
Sử dụng plasmid siêu xoắn chứa vị trí nhận dạng TelN Protelomerase làm khuôn mẫu, thêm TelN Protelomerase của
Hình 6. Kiểm tra tính toàn vẹn của phần đóng đầu của TelN Protelomerase. C1: plasmid chứa vị trí nhận dạng TelN, không có TelN Protelomerase; C2: plasmid chứa vị trí nhận dạng TelN, TelN Protelomerase, không có exonuclease T5; Plasmid: plasmid chứa vị trí nhận dạng TelN.
Sản phẩm liên quan của Tổng hợp ADN bằng Enzym
| Phân loại sản phẩm | Tên sản phẩm | Số danh mục |
| Protelomerase | 14540ES | |
| DNA polymerase Phi29 | 14404ES | |
| exonuclease | Exonuclease III | 14525ES |
| 14538ES | ||
| dNTP | 10125ES |
Rtài liệu tham khảo
[1] Giardini MA, Segatto M, da Silva MS, Nunes VS, Cano MI. Telomere và Protelomase sinh học. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.
[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Mini DNA khép kín tuyến tính được tạo ra bởi enzyme cắt-nối TelN ở sinh vật nhân sơ có chức năng trong tế bào động vật có vú. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.
[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Mini DNA khép kín tuyến tính được tạo ra bởi enzyme cắt-nối TelN ở sinh vật nhân sơ có chức năng trong tế bào động vật có vú. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.