Reverse transcriptase, còn được gọi là RNA-dependent DNA polymerase, là một enzyme DNA polymerase phiên mã RNA mạch đơn thành DNA. Hiệu suất của reverse transcriptase sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất cuối cùng của thuốc thử chẩn đoán phân tử. Để đáp ứng các điểm đau của các nhà sản xuất thuốc thử chẩn đoán phân tử, Yeasen đã thực hiện chuyển đổi định hướng trên phiên mã ngược. Phiên mã ngược có hiệu suất tuyệt vời và được khách hàng đón nhận nồng nhiệt!

1. Chức năng của phiên mã ngược là gì?
2. Làm thế nào để chọn phiên mã ngược?
3. Tại sao chọn Yeasenphiên mã ngược của?
4. Sản phẩm liên quan và hiệu suất
5. Sản phẩm liên quan

1. Chức năng của phiên mã ngược là gì?

Reverse transcriptase là một DNA polymerase phụ thuộc RNA. Nó có thể phiên mã RNA khuôn mẫu và tạo thành DNA bổ sung (cDNA). cDNA mạch đơn được chuyển đổi thành DNA mạch đôi bằng cách sử dụng DNA polymerase. Vì vậy, reverse transcriptase thường được sử dụng để định lượng mức độ tổng hợp mRNA khi kết hợp với kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase, được gọi là RT-PCR. Các xét nghiệm RT-PCR định lượng thường được sử dụng trong chẩn đoán bệnh. Do đó, reverse transcriptase đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu khoa học và ứng dụng thực tế.

2. Làm thế nào để chọn phiên mã ngược?

Các phiên mã ngược phổ biến là M-MLV và AMV, trong đó M-MLV tốt hơn AMV. Nhưng các enzyme RT thông thường có hai vị trí hoạt động, một thực hiện các hoạt động của polymerase và một thực hiện hoạt động của ribonuclease H. RNase H là một endonuclease có khả năng phân hủy phần RNA của họ DNA-RNA lai. Do đó, phiên mã ngược thiếu hoạt động RNase H có lợi cho quá trình tổng hợp cDNA. Bên cạnh đó, sử dụng phiên bản RT chịu nhiệt có lợi cho việc giảm khuếch đại axit nucleic không đặc hiệu và giảm thiểu tác động của các cấu trúc thứ cấp phức tạp.

3. Tại sao chọn Yeasenphiên mã ngược của?

Yeasen đã thực hiện sửa đổi định hướng trên phiên mã ngược, loại bỏ hoạt động của RNase H, do đó cải thiện khả năng tổng hợp cDNA. Sử dụng công nghệ tiến hóa protein để cải thiện khả năng chịu nhiệt của phiên mã ngược.

Yeasen's reverse transcriptase không chỉ có khả năng tổng hợp mạnh mà còn có khả năng dung nạp mạnh. Ngoài ra, Yeasen có yêu cầu nghiêm ngặt về chất lượng. Đây là lựa chọn tốt nhất cho phiên mã ngược.

4. Sản phẩm liên quan và hiệu suất

4.1 Chịu được nhiệt độ cao 65°C

Sử dụng 500ng RNA tổng số tế bào 293T làm khuôn mẫu, phiên mã ngược được thực hiện ở 42°C-65°C bằng cách sử dụng Hifair™ Ⅲ Reverse Transcriptase. Lấy 1 μL cDNA làm khuôn mẫu để khuếch đại gen TFRC (4,4kb).

Hình 1. Thực hiện phiên mã ngược ở 42°C-65℃

4.2 Tương thích với các mẫu phức tạp

Nhiệt độ phản ứng 55°C có thể đáp ứng được quá trình phiên mã ngược của các khuôn mẫu thông thường và khuôn mẫu cấu trúc thứ cấp, và nhiệt độ phản ứng của các khuôn mẫu GC cao có thể được tăng lên thích hợp đến 65°C.

Hình 2.Phù hợp với các mẫu giàu GC và các mẫu cấu trúc thứ cấp

4.3 Hiệu suất mở rộng tuyệt vời

Sử dụng 500ng tổng RNA của tế bào 293T làm khuôn mẫu và Oligo(dT) làm mồi, cDNA được tổng hợp bằng cách sử dụng Hifair™ Ⅲ Reverse Transcriptase. Lấy 1 μL cDNA làm khuôn mẫu để khuếch đại 500bp của 5' gen DY1C1N1 (19,9kb). Kết quả cho thấy Hifair™ Ⅲ Reverse Transcriptase có thể tổng hợp cDNA lên đến 19,8kb.

Hình 3. Có thể tổng hợp cDNA lên đến 19,8kb

4.4 Tổng hợp nhanh

Sử dụng RNA của tế bào 293T làm khuôn mẫu, phiên mã ngược được thực hiện theo quy trình chuẩn trong hướng dẫn và thời gian phiên mã ngược được thiết lập theo thứ tự là 5, 10, 15, 30, 45 và 60 phút. Hifair™ III Reverse Transcriptase có thể tổng hợp cDNA 6kb trong vòng 5 phút và tính đặc hiệu cũng như năng suất của nó vượt trội hơn so với thương hiệu V.

Hình 4. 6kb cDNA có thể được tổng hợp trong vòng 5 phút

4.5 Phạm vi tuyến tính rộng

Sử dụng 5pg-5μg tổng RNA của tế bào 293T làm khuôn mẫu, cDNA được tổng hợp bằng cách sử dụng Hifair™ III Reverse Transcriptase. 1 μL cDNA được sử dụng làm khuôn mẫu, và qPCR được thực hiện trên bốn gen, và kết quả cho thấy hiệu suất khuếch đại đều nằm trong khoảng từ 98% đến 100,10%. Điều này cho thấy cDNA có thể được tổng hợp hiệu quả trong một phạm vi tuyến tính rộng của các khuôn mẫu.

Hình 5. cDNA có thể được tổng hợp hiệu quả trong một phạm vi khuôn mẫu rộng

4.6 Kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt

Để đảm bảo hiệu suất ổn định của Yeasenenzyme đảo ngược của, Yeasen thực hiện nghiêm ngặt các yêu cầu trong quy trình sản xuất để ổn định quy trình sản xuất và đảm bảo tính ổn định của lô. Đồng thời, tăng cường kiểm tra chất lượng để phát hiện các chất dư bao gồm exonuclease, nickase, RNase, v.v., để đảm bảo không có dư lượng, để không ảnh hưởng đến các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 6. Phát hiện dư lượng

5. Sản phẩm liên quan

Các sản phẩm được cung cấp bởi Yeasen như sau.

Bảng 1. Sản phẩm liên quan

Về Đọc

Hướng dẫn lựa chọn phiên mã ngược

Yeasen UDG: "Chuyên gia chống bám bẩn" trong phản ứng PCR