dNTP là viết tắt của ribonucleotide triphosphate có hoa văn được sử dụng trong PCR, có khả năng khuếch đại một chuỗi DNA đang phát triển. Nói cách khác, dNTP trong PCR liên kết với các chuỗi DNA bổ sung thông qua liên kết hydro và các chuỗi DNA đang phát triển được mở rộng với sự trợ giúp của Taq DNA polymerase. Ứng dụng cụ thể của dNTP trong PCR là gì? Các dNTP có độ tinh khiết cao cần có những đặc tính nào?

1. dNTP là gì?
2. Nồng độ dNTP trong PCR là bao nhiêu?
3. Những tính chất cần thiết của dNTP có độ tinh khiết cao là gì?
4. Sản phẩm liên quan và hiệu suất

1. dNTP là gì?

Deoxynucleoside triphosphate (dNTP) là nucleoside triphosphate chứa deoxyribose, một chuỗi nucleotide bao gồm ribose, một bazơ và một phosphate. dNTP là các khối xây dựng thiết yếu của các phân tử axit nucleic và do đó là các thành phần cần thiết của hỗn hợp PCR vì không thể tạo ra DNA khuếch đại mới nếu không có chúng. Bốn deoxynucleotide riêng lẻ tạo nên trình tự DNA bao gồm deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxythymidine triphosphate (dTTP), deoxycytidine triphosphate (dCTP) và deoxyguanosine triphosphate (dGTP). Ngoài ra, chất lượng của dNTP cũng rất quan trọng đối với sự thành công của nhiều quy trình như PCR, tổng hợp cDNA, qPCR, giải trình tự, nhân bản và gắn nhãn DNA.

Có bốn loại dNTP, hay deoxynucleotide triphosphate, mỗi loại sử dụng một loại bazơ DNA khác nhau: adenine (dATP), cytosine (dCTP), guanine (dGTP) và thymine (dTTP). Sử dụng dNTP trong giai đoạn kéo dài cung cấp các bazơ đơn sẵn sàng đi vào DNA và nhân đôi nó, giống như các khối xây dựng. Vì mục đích của kỹ thuật này là tổng hợp DNA mới, dNTP cung cấp nucleotide cho sợi “đã giải nén” bằng cách sử dụng khuôn mẫu của một mặt duy nhất. Điều này biến một sợi DNA đơn thành hai và có thể tiếp tục theo cấp số nhân miễn là thuốc thử vẫn còn cho đến giai đoạn giữ cuối cùng.

2. Nồng độ dNTP trong PCR là bao nhiêu?

PCR là một kỹ thuật tổng hợp DNA trong ống nghiệm được thực hiện để tạo ra nhiều bản sao của một đoạn DNA quan tâm để có thể quan sát được khi điện di trên gel. Mục đích của PCR là tạo ra một số lượng lớn các bản sao DNA cho nhiều ứng dụng hạ nguồn khác nhau trong giải trình tự DNA hoặc mảng DNA. Các thành phần của PCR bao gồm khuôn DNA, mồi, đệm và Taq DNA polymerase dNTP. Để hiểu cơ chế của PCR, cần phải hiểu tầm quan trọng và nguyên lý của các thành phần được sử dụng. dNTP là một trong những thành phần chính của PCR. Chức năng của dNTP trong PCR là khuếch đại chuỗi DNA đang phát triển với sự trợ giúp của Taq DNA polymerase và kết hợp với chuỗi DNA bổ sung thông qua liên kết hydro.

Quá trình PCR được chia thành ba bước phụ thuộc vào nhiệt độ: biến tính, ủ và kéo dài. Trong bước biến tính, DNA mạch đôi bị biến tính thành DNA mạch đơn. Trong bước ủ, các đoạn mồi liên kết tại vị trí chính xác của trình tự bổ sung của chúng và trong bước kéo dài, Taq DNA polymerase thêm dNTP vào chuỗi DNA đang phát triển. Khi các sợi được mở ra và các đoạn mồi liên kết với DNA mạch đơn, Taq DNA polymerase bắt đầu hoạt động xúc tác của nó. Ở bước tiếp theo, quá trình bổ sung dNTP bắt đầu, liên kết với phức hợp P-DNA với ái lực thấp hơn nếu có nucleotide bổ sung chính xác. Ngay sau khi Taq DNA polymerase giữ nguyên, các tương tác liên kết hydro giữa các bazơ bổ sung và dNTP xảy ra. Ở đây, không phải toàn bộ nucleotide lúc đầu, mà là bazơ (bazơ nitơ) trên dNTP quyết định có liên kết hay không.Đầu tiên, nếu nó tìm thấy một bazơ bổ sung (A đối với T, G đối với C) trên khuôn mẫu ssDNA, nó sẽ hình thành một liên kết hydro giữa chúng. Ba liên kết hydro giữa C và G và hai liên kết hydro giữa A và T được tạo ra. Sau khi liên kết hydro được hình thành, Taq DNA polymerase tuân thủ việc kết hợp dNTP vào chuỗi DNA đang phát triển bằng cách hình thành liên kết phosphodiester. Bây giờ sau khi liên kết phosphodiester được hình thành, Taq DNA polymerase tiến thêm một bước nữa trong việc thêm các dNTP mới. Một liên kết phosphodiester được hình thành giữa 3'OH của mồi và 5'P của dNTP. Sau khi liên kết hydro, Taq DNA polymerase xúc tác phản ứng bằng cách loại bỏ gamma và beta-phosphate khỏi triphosphate của dNTP. Sau khi phản ứng hoàn tất, hai pyrophosphate (PPi) được giải phóng. Nhưng động học chính xác của tương tác dNTP và Taq polymerase trong phản ứng PCR vẫn chưa được biết.

Bốn nucleotide này thường được thêm vào phản ứng PCR với số lượng mol bằng nhau để kết hợp bazơ tối ưu. Tuy nhiên, trong một số tình huống nhất định như đột biến ngẫu nhiên bằng PCR, nồng độ dNTP không cân bằng được cung cấp một cách có chủ ý để thúc đẩy mức độ kết hợp sai cao hơn bởi một DNA polymerase không đọc sửa. Yếu tố quyết định nồng độ dNTP tối thiểu là độ dài DNA và thành phần của trình tự mục tiêu. Trong phản ứng PCR, dNTP thường là 50-200 μmol/L. Khi nồng độ dNTP cuối cùng lớn hơn 50 mmol/L, nó có thể ức chế hoạt động của Taq DNA polymerase. Nồng độ của bốn dNTP phải bằng nhau để giảm sự kết hợp sai trong quá trình khuếch đại do thiếu một dNTP.

Trong các ứng dụng PCR thông thường, nồng độ cuối cùng được khuyến nghị của mỗi dNTP thường là 0,2 mM. Nồng độ cao hơn có thể hữu ích trong một số trường hợp, đặc biệt là khi có nồng độ Mg cao²⁺, như Mg²⁺ liên kết với dNTP và làm giảm tỷ lệ kết hợp của chúng, làm tăng tỷ lệ không đặc hiệu. dNTP chứa phosphate, có thể kết hợp với Mg²⁺ để giảm nồng độ Mg tự do²⁺, vì vậy sự thay đổi nồng độ của nó sẽ ảnh hưởng đến nồng độ hiệu dụng của Mg²⁺. Trong điều kiện nồng độ DNA và dNTP cao, Mg²⁺ nồng độ nên được điều chỉnh cho phù hợp. Ngoài ra, sự khan hiếm dNTP dẫn đến các sản phẩm PCR không đầy đủ. Tuy nhiên, dNTP vượt quá nồng độ tối ưu có thể ức chế PCR. Để DNA polymerase kết hợp hiệu quả, dNTP tự do phải có trong phản ứng ở nồng độ không dưới 0,01-0,015 mM.

3. Những tính chất cần thiết của dNTP có độ tinh khiết cao là gì?

Kể từ khi phát hiện ra, phản ứng chuỗi polymerase là công cụ vô song được sử dụng trong nghiên cứu di truyền phân tử. dNTP được sử dụng trong PCR để mở rộng chuỗi DNA đang phát triển. Ngay cả khi chất lượng dNTP trong hệ thống kém, nó sẽ có tác động tiêu cực đến các đặc tính của sản phẩm cuối cùng. YeasendNTP có độ tinh khiết cao phù hợp với mọi loại ứng dụng tổng hợp DNA có độ nhạy cao và khả năng tái tạo.

Yeasen cung cấp các nucleotide, bộ và hỗn hợp GMP đã sẵn sàng sử dụng, được cung cấp dưới dạng muối natri trong nước tinh khiết ở độ pH 7,0. Quy trình sản xuất loại bỏ tạp chất và chất ức chế đặc hiệu PCR, và dNTP được sản xuất đặc biệt cho các ứng dụng sinh học phân tử. Các dNTP được tinh chế bằng HPLC chuẩn bị và có độ tinh khiết ít nhất 99%. Chúng có thể được sử dụng trong các quy trình PCR, RT-qPCR, LAMP, đánh dấu DNA và giải trình tự DNA.
Tiêu chuẩn kiểm soát nghiêm ngặt và công nghệ tiên tiến đảm bảo chất lượng tốt nhất của sản phẩm. Mỗi lô dNTP được thử nghiệm các chất cặn bã khác nhau (DNA vi khuẩn, DNA người, DNase, RNase, Endonuclease).Sản phẩm có độ ổn định theo từng lô và phù hợp với mọi loại ứng dụng tổng hợp DNA có độ nhạy cao và khả năng tái tạo.

4. Sản phẩm liên quan và hiệu suất

4.1 Không có dư lượng DNA của vi khuẩn

Hình 1. Kết quả phát hiện cho thấy dNTP không có dư lượng bộ gen vi khuẩn.

4.2 Không có dư lượng DNA của con người

Hình 2. Kết quả phát hiện cho thấy dNTP không có dư lượng gen người.

4.3 Không có DNase, RNase và nhiễm Endonuclease

Hình 3. Kết quả phát hiện cho thấy dNTP không có DNase, RNase và Endonuclease.

4.4 Khuếch đại PCR (DNA 20 kb)

Hình 4. Kết quả khuếch đại PCR là sản phẩm mong đợi có kích thước 20 kb.

4.5 Thông tin sản phẩm

Các sản phẩm được cung cấp bởi Yeasen như sau.

Bảng 1.Thông tin sản phẩm