Từ tháng 3 năm 2022, chủng đột biến Omicron xảo quyệt một lần nữa phá vỡ cuộc sống yên bình của người dân, dịch bệnh do virus corona mới bùng phát trên khắp cả nước và ảnh hưởng đến 30 tỉnh (khu tự trị và thành phố). Là một biện pháp hiệu quả để phòng ngừa và kiểm soát chính xác dịch bệnh SARS-CoV-2, phát hiện axit nucleic đã trở thành một cách sống bình thường. "Hôm nay bạn đã làm xét nghiệm axit nucleic chưa?" Nó cũng đã trở thành lời chào hàng ngày của mọi người. Nói đến đó, bạn có biết những nguyên liệu thô cốt lõi nào là cần thiết trong quá trình phát hiện axit nucleic không? Bài viết này sẽ giới thiệu về nguyên liệu thô cốt lõi quan trọng trong enzyme phát hiện axit nucleic.

1. Quy trình phát hiện axit nucleic cho SARS-CoV-2

2. Enzym cốt lõi trong chiết xuất axit nucleic

3. Các enzyme cốt lõi trong RT-qPCR

4. Các Enzym cốt lõi của Phát hiện Axit Nucleic SARS-CoV-2 từ Yeasen

1. Quy trình phát hiện axit nucleic đối với SARS-CoV-2

Enzym là một lớp chất xúc tác sinh học cực kỳ quan trọng với hiệu suất xúc tác và tính đặc hiệu phản ứng cao. Hầu hết các phản ứng sinh hóa đều cần sự tham gia của enzim. Trong quá trình phát hiện axit nucleic của 2019-nCoV (thể hiện trong Hình 1), các loại enzim phân tử khác nhau đóng vai trò quan trọng trong các giai đoạn thử nghiệm khác nhau như chiết xuất axit nucleic và RT-qPCR. Tiếp theo, theo các liên kết thử nghiệm khác nhau trong quá trình phát hiện axit nucleic, chúng tôi sẽ phân loại các nguyên liệu thô của enzim cốt lõi được sử dụng trong quá trình phát hiện axit nucleic.

Hình 1. Quy trình phát hiện axit nucleic đối với SARS-CoV-2

2. Các enzyme cốt lõi trong chiết xuất axit nucleic

Quá trình chiết xuất axit nucleic của virus corona mới chủ yếu bao gồm hai bước: ly giải và tinh chế. Ly giải là quá trình phá hủy cấu trúc tế bào của mẫu để axit nucleic trong mẫu được tự do trong hệ thống ly giải; Tinh chế là quá trình tách hoàn toàn axit nucleic khỏi các thành phần khác trong hệ thống ly giải, chẳng hạn như protein, muối và các tạp chất khác, và quá trình phản ứng đòi hỏi sự tham gia của proteinase K, deoxyribonuclease I và chất ức chế RNase.

2.1 Protease K

Proteinase K là một protease serine có hoạt tính cắt rộng, các vị trí cắt là các liên kết peptide đầu carboxyl của các axit amin aliphatic và thơm (Hình 2). Trong quá trình chiết xuất axit nucleic, proteinase K có thể phân hủy các histon liên kết chặt chẽ với axit nucleic, thúc đẩy quá trình tách axit nucleic và giúp axit nucleic mẫu dễ chiết xuất hơn. Ngoài ra, proteinase K có thể phân hủy hoạt động của RNA hydrolase (RNase) và ức chế quá trình thủy phân RNA khuôn mẫu của RNase.

Hình 2. Sơ đồ của proteinase K thủy phân liên kết peptide

Yeasen Công nghệ sinh học Proteinase K (Cat#10401ES) có nguồn gốc từ chủng nấm men tái tổ hợp, hoạt động đặc hiệu ≥30 U/mg, không chứa RNase và DNase, hoạt động enzyme ổn định trong dung dịch urê và SDS. Hoạt động trong phạm vi pH rộng (pH 4,0~12,0), thích hợp cho việc cắt và loại bỏ protein như chuẩn bị mẫu lai in situ và tinh chế axit nucleic.

2.2 Deoxyribonuclease I

Deoxyribonuclease I (DNase I) có thể xúc tác nhiều dạng DNA khác nhau, nhắm tới mục tiêu cắt các liên kết phosphodiester liền kề với pyrimidine và tạo ra polynucleotide có nhóm phosphate ở đầu 5' và nhóm hydroxyl ở đầu 3', sản phẩm tiêu hóa trung bình là polytetranucleotide nhỏ nhất.Trong quá trình chiết xuất axit nucleic SARS-CoV-2, DNase I chủ yếu được sử dụng để loại bỏ tạp chất bộ gen trong mẫu RNA, tránh dư lượng DNA trong khuôn mẫu RNA và cải thiện độ tinh khiết của khuôn mẫu.

Yeasen Công nghệ sinh học DNase I (Cat#10325ES) có nguồn gốc từ các chủng E. coli tái tổ hợp, không có RNase và có thể được sử dụng để xử lý nhiều mẫu RNA khác nhau. phạm vi pH làm việc tối ưu là 7,0-8,0. Khi có Mg2+, DNase I có thể cắt ngẫu nhiên bất kỳ vị trí nào của DNA sợi đôi; trong khi khi có Mn²⁺DNase I có thể cắt DNA mạch đôi tại cùng một vị trí, tạo thành đầu tù hoặc đầu dính nhô ra 1-2 nucleotide (như thể hiện trong Hình 3).

Hình 3. Sơ đồ phân cắt dsDNA của DNase I khi có mặt Mg²⁺ và Mn²⁺

2.3 Chất ức chế RNase

Trong quá trình phát hiện axit nucleic SARS-CoV-2, việc chiết xuất và tinh chế axit nucleic mẫu hoặc chuẩn bị hệ thống phản ứng thử nghiệm có thể dẫn đến nhiễm bẩn ribonuclease (RNase), dẫn đến sự phân hủy khuôn mẫu RNA. Để tránh nhiễm bẩn RNase, cần có Chất ức chế RNase.

Chất ức chế RNase là chất ức chế RNase đặc hiệu trong nhau thai người, có khả năng liên kết đặc hiệu với RNase để tạo thành phức hợp có liên kết không cộng hóa trị và vô hiệu hóa RNase. Yeasen Công nghệ sinh học Chất ức chế RNase ở chuột (Cat#10603ES) không chứa hai cysteine ​​rất nhạy cảm với quá trình oxy hóa trong protein của con người. Nó có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn và có thể ức chế rộng rãi nhiều loại RNase (RNase A, B, C), phù hợp hơn cho các thí nghiệm nhạy cảm với dithiothreitol (DTT) cao như qPCR.

3. Các enzyme cốt lõi trong RT-qPCR

Sau khi hoàn tất quá trình chiết xuất axit nucleic của mẫu SARS-CoV-2, việc phát hiện axit nucleic có thể được hoàn tất bằng RT-qPCR. Trong quá trình thực hiện các thí nghiệm này, DNA polymerase, reverse transcriptase và uracil DNA glycosylase đều là nguyên liệu cốt lõi thiết yếu của enzyme.

3.1 Phiên mã ngược

Sau khi chiết xuất và tinh chế, RNA SARS-CoV-2 cần phiên mã ngược để xúc tác quá trình trùng hợp dNTP để tạo ra trình tự cDNA bổ sung cho RNA khuôn mẫu (Hình 4). Đối với phản ứng RT-qPCR, nên chọn phiên mã ngược chịu nhiệt độ cao. Hiện nay, phiên mã ngược MMLV được sử dụng rộng rãi nhất, do không có hoạt tính endonuclease DNA và hoạt tính RNase H thấp, nên có nhiều ưu điểm hơn trong ứng dụng nhân bản cDNA.

Hình 4. Sơ đồ quá trình phiên mã ngược

Yeasen Công nghệ sinh học Hifair™ V Phiên mã ngược (Cat#11300ES) là một phiên mã ngược mới thu được bằng công nghệ kỹ thuật di truyền. Nó có độ ổn định nhiệt tốt và có thể chịu được nhiệt độ phản ứng lên tới 60°C. Và nó cũng thích hợp cho phiên mã ngược của khuôn mẫu RNA có cấu trúc thứ cấp phức tạp. Đồng thời, enzyme tăng cường ái lực với khuôn mẫu, thích hợp cho phiên mã ngược của một số lượng nhỏ khuôn mẫu và gen có bản sao thấp và có thể khuếch đại cDNA lên đến 10 kb.

3.2 ADN polymerase

Sau khi quá trình phiên mã ngược khuôn mẫu hoàn tất để tạo ra cDNA mạch kép, DNA polymerase "linh hồn" trong phản ứng PCR cần phải xuất hiện, bằng cách trùng hợp các deoxyribonucleotide tự do để kéo dài chuỗi DNA và một lượng lớn DNA khuôn mẫu được khuếch đại trong ống nghiệm để đạt được mục đích phát hiện axit nucleic của vi-rút.

DNA polymerase thường được sử dụng trong phản ứng RT-qPCR là hot-start Taq DNA polymerase. Loại enzyme này không hoạt động ở nhiệt độ phòng.Nó chỉ có hoạt động trùng hợp sau khi khởi động nóng, có thể giảm thiểu việc tạo ra tín hiệu nền. Nó giải quyết các vấn đề khuếch đại không đặc hiệu do tạo ra primer-dimer hoặc không khớp trong các phản ứng PCR thông thường. Hiện nay, các phương pháp sửa đổi khởi động nóng DNA polymerase thường được sử dụng chủ yếu bao gồm sửa đổi hóa học, sửa đổi phối tử và sửa đổi kháng thể. Các nguyên tắc của các phương pháp sửa đổi khởi động nóng khác nhau được thể hiện trong Hình 5.

Hình 5. Sơ đồ các loại enzyme khởi động nóng được biến đổi khác nhau

Yeasen Công nghệ sinh học UNICONTM Hotstart Taq DNA Polymerase đặc hiệu cao, 5 U/μL (Cat#10726ES) là một DNA polymerase khởi động nóng chặn kép có ái lực khuôn mẫu cao. Ở nhiệt độ phòng, không chỉ 5'→3' hoạt động của polymerase bị chặn, nhưng cũng như 5'→3' Hoạt động của exonuclease bị chặn. Biến tính ở 95°C trong 30 giây có thể vô hiệu hóa hoàn toàn kháng thể chặn, giải phóng hoạt động của DNA polymerase và hoạt động của exonuclease. Tính năng chặn kép không chỉ có thể ngăn ngừa hiệu quả sự khuếch đại không đặc hiệu do sự không khớp hoặc các cặp mồi-dimer, mà còn ức chế hiệu quả sự suy giảm tín hiệu huỳnh quang do sự thoái hóa của đầu dò. Đảm bảo kép giúp thuốc thử phát hiện trong ống nghiệm ổn định hơn trong quá trình vận chuyển hoặc sử dụng ở nhiệt độ phòng.

3.3 Uracil ADN glycosylase

Trong quá trình phát hiện axit nucleic của virus corona mới, ô nhiễm khí dung trong môi trường hoạt động là yếu tố phổ biến nhất gây ra kết quả PCR dương tính giả. Việc thêm enzyme UDG (Uracil DNA Glycosylase, uracil DNA glycosylase) vào hệ thống khuếch đại có thể loại bỏ hiệu quả các chất ô nhiễm còn sót lại của quá trình khuếch đại (chủ yếu ở dạng khí dung) trộn lẫn trong hệ thống PCR để đảm bảo độ chính xác của kết quả khuếch đại. Nguyên lý chống ô nhiễm của enzyme UDG được thể hiện trong Hình 6.

Hình 6. Sơ đồ nguyên lý chống ô nhiễm của enzyme UDG

Yeasen Công nghệ sinh học Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), không bền với nhiệt, 1 U/μL (Cat#10303ES) hoạt động ở 25-37°C, nhạy cảm với nhiệt và bị bất hoạt không thể đảo ngược ở 50°C trong 10 phút hoặc 95°C trong 2 phút. Không có endonuclease và RNase còn lại, và số lượng bộ gen của vi khuẩn chủ ít hơn 10 bản sao. Có thể sử dụng kết hợp với Taq DNA polymerase khởi động nóng để đảm bảo tính đặc hiệu của phản ứng khuếch đại.

4.Các Enzym cốt lõi của Phát hiện Axit Nucleic SARS-CoV-2 từ Yeasen

Về việc đọc:

Lựa chọn phiên mã ngược

Yeasen UDG không chịu nhiệt——Dễ dàng kiểm soát ô nhiễm khí dung

Chất ức chế RNase ở chuột - Loại bỏ thành công sự nhiễm bẩn RNase và bảo quản RNA