Với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học, liệu pháp mRNA, như một phương pháp điều trị mới nổi, đã thu hút được nhiều sự chú ý do khả năng lập trình mạnh mẽ và tốc độ phản ứng nhanh. Trong lĩnh vực vắc-xin mRNA và liệu pháp gen, tổng hợp hiệu quả mRNA chất lượng cao là một bước quan trọng để đạt được mục tiêu điều trị. Trong quá trình này, T7 RNA polymerase (T7 RNAP) đóng vai trò thiết yếu, nó có thể xúc tác hiệu quả quá trình tổng hợp mRNA trong ống nghiệm.
Mặc dù T7 RNAP đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp mRNA, nhưng trên thực tế, nó thường tạo ra RNA mạch kép (dsRNA) như một sản phẩm phụ. dsRNA là một trong những đặc điểm nổi bật của nhiều loại virus, do đó nó dễ dàng được nhận biết bởi các protein liên kết dsRNA nội bào, kích hoạt phản ứng miễn dịch bẩm sinh và phản ứng viêm. Điều này có nghĩa là nếu các công thức mRNA chứa mức dsRNA cao hơn, nó có thể dẫn đến hoạt hóa miễn dịch không cần thiết, có thể ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị hoặc gây ra các tác dụng phụ nghiêm trọng. Quá nhiều dsRNA cũng có thể can thiệp vào chức năng bình thường của mRNA, bao gồm hiệu quả dịch mã và tính ổn định của mRNA, gián tiếp ảnh hưởng đến hiệu quả của liệu pháp mRNA.
Hình 1: Tác động của sản phẩm phụ dsRNA và phản ứng T7 RNAP được tối ưu hóa.
Do đó, việc phát triển và áp dụng các phương pháp hiệu quả để giảm sự tạo ra dsRNA là một phần quan trọng trong quá trình phát triển công nghệ mRNA. Các nhà nghiên cứu đã phát triển nhiều chiến lược khác nhau, bao gồm việc sử dụng các polymerase RNA T7 cải tiến, các nucleotide sửa đổi, tối ưu hóa các đệm phiên mã IVT và các quy trình tinh chế hạ nguồn.
Dữ liệu sản phẩm
Năng suất: trên 9 mg/mL
Nội dung dsRNA: nội dung dsRNA đã giảm đáng kể ít nhất 10 lần
Hiệu quả đóng nắp: trên 99%
RNA polymerase T7 dsRNA thấp Quy trình sàng lọc:
1) xây dựng một thư viện ngẫu nhiên và phương pháp sàng lọc thông lượng cao FADS, một thư viện đột biến ngẫu nhiên trên 10^6 đã được sàng lọc.
2) thiết kế bán hợp lý và công nghệ vi mạch được sử dụng để sàng lọc thư viện bão hòa vị trí. Cả hai phương pháp đều tạo ra đột biến RNA polymerase T7 dsRNA thấp. Xem xét hàm lượng dsRNA trong khi đảm bảo rằng các chỉ số khác không bị giảm (như tính toàn vẹn/hiệu quả đóng nắp/năng suất, v.v.), một số đột biến đã được chọn và một đột biến có tên là CleaScrip™ T7 đã được sử dụng cho mục đích thương mại.
Dữ liệu sản phẩm
Trong các kịch bản ứng dụng có độ dài khác nhau, hàm lượng RNA Polymerase T7 dsRNA thấp đã cho thấy sự giảm đáng kể so với cả sản phẩm WT T7 và sản phẩm cạnh tranh, đồng thời đảm bảo rằng Năng suất và tính toàn vẹn không bị giảm.
| Chiều dài đoạn văn | RNA pol T7 | Năng suất（mg/mL) |
Chính trực(%) | Hàm lượng dsRNA (ng dsRNA được sản xuất trên 1ug RNA) |
| 4K | T7-WT | 12.4 | 88,3 | 0,4273 |
| Xóa bỏ™ T7 | 12.1 | 89,9 | 0,0129 | |
| Công ty A | 11.0 | 87,8 | 0,0323 | |
| 9K | T7-WT | 9,5 | 81,9 | 2.9180 |
| Xóa bỏ™ T7 | 9.0 | 82.0 | 0,0379 | |
| Công ty A | 7.2 | 78,7 | 0,1805 |
Sử dụng nồng độ mũ là 2,5 mM, hiệu quả mũ tuyệt vời vẫn có thể đạt được trên các chiều dài đoạn khác nhau so với WT. Ngoài ra, hiệu suất biểu hiện protein vượt trội cũng được quan sát thấy ở cấp độ tế bào.
| Đầu vào tương tự của nắpMM) | Hiệu quả đóng nắp%)4K | |
| WT | dsRNA thấp | |
| 10 | 100 | 100 |
| 5 | 100 | 100 |
| 2,5 | 100 | 100 |
Bằng sáng chế đã được nộp tại Hoa Kỳ.
Thông tin sản phẩm
| Tên sản phẩm | Số danh mục | Đặc điểm kỹ thuật | Âm lượng |
| Xóa mãTM RNA polymerase T7 (dsRNA thấp, 250 U/μL) | 10628ES | 100/2500/25.000KU | 400 μL/10mL/100mL |
| Xóa mãTM T7 RNA Polymerase đạt chuẩn GMP (dsRNA thấp, 250 U/μL) | 10629ES | 100/2500/25.000KU | 400 μL/10mL/100mL |