Các ngàysự mô tả của Bộ tổng hợp RNA năng suất cao T7
Bộ tổng hợp RNA năng suất cao T7 tối ưu hóa hệ thống phản ứng phiên mã. Bộ này có thể tổng hợp RNA sợi đơn hiệu quả bằng cách sử dụng T7 RNA polymerase, tôiDNA sợi đôi inearized với trình tự khởi động T7 làm khuôn mẫu, NTP làm chất nền để phiên mã trình tự DNA hạ lưu của trình tự khởi động. Trong quá trình phiên mã, các nucleotide đã sửa đổi có thể Mà còn được thêm vào như chất nền để sản xuất biotin hoặc RNA gắn thuốc nhuộm.
Bộ dụng cụ này có thể tổng hợp cả hai bản sao dài và bản sao ngắn, RNA có thể được sản xuất 100-200 μg với 1 μg DNA template đầu vào. RNA được tổng hợp bằng phiên mã có thể được sử dụng cho nhiều ứng dụng hạ nguồn khác nhau, chẳng hạn như nghiên cứu cấu trúc và chức năng của RNAgiờes, bảo vệ RNase, lai hóa đầu dò, RNAi, tiêm vi mô và dịch mã trong ống nghiệm.
Nguyên lý tổng hợp
Hình 1: Quá trình phiên mã RNA trong ống nghiệm
Ưu điểm của sản phẩm
Năng suất cao: có thể sản xuất tới 200 μg trong 2 giờ thông qua phản ứng phiên mã
Tính linh hoạt tốt hơn: thích hợp cho phiên mã RNA 20nt-10000nt
Hiệu suất tuyệt vời: giảm hiệu quả các sản phẩm phụ của quá trình phiên mã trong quá trình IVT
Nhiều ứng dụng: có thể được sử dụng cho tổng hợp RNA thông thường, được gắn nhãn và được sửa đổi
Thuộc tính sản phẩm
Hình 2: Sản lượng bản sao có độ dài khác nhau
Hình 3: Chất lượng của các bản sao có độ dài khác nhau
Hình 4: Biểu hiện của đã chép lại mARN TRONG HEK-293 tế bào
Lưu ý: mRNA đã được giới hạn bằng Enzym giới hạn Vaccinia (
Phương pháp thực nghiệm
Thuốc thử rã đôngLy tâm hỗn hợp T7 RNA Polymerase trong thời gian ngắn và đặt Nó trên băng. Rã đông 10×Đệm phiên mã và ribonucleotideS (ATP, CTP, GTP, UTP), trộn đều và ly tâm đến đáy ống, đặt đệm phiên mã 10× ở nhiệt độ phòng và đặt 4 loại ribonucleotide vào đá.
B.Phản ứng phiên mã lắp ráp ở nhiệt độ phòngChuẩn bị hệ phản ứng theo phương trình sau:
| Thành phần | Thể tích (µL) | Nồng độ cuối cùng |
| RNase miễn phí H2Ồ | Lên đến 20 | - |
| 10×Bộ đệm phiên mã | 2 | 1× |
| CTP / GTP/ ATP/ UTP (mỗi loại 100 mM) | 2 mỗi cái | 10 mM mỗi loại |
| Mẫu DNA | 1 µg | - |
| Hỗn hợp RNA Polymerase T7 | 2 | - |
Ghi chú:
- Phản ứng được cấu hình ở nhiệt độ phòng. Vì đệm phiên mã 10× chứa spermidine, nồng độ spermidine cao có thể gây ra sự kết tủa khuôn DNA ở nhiệt độ thấp.
Đối với bản sao ngắn (<100 nt), có thể sử dụng khuôn mẫu 2 µg, thời gian phiên mã kéo dài đến 4-8 giờ.
3. Đối với bản sao dài (>1000 nt), nên sử dụng plasmid tuyến tính làm khuôn mẫu cho phiên mã.
4. Thực hiện phản ứng trong thiết bị PCR khi nắp nóng mở để tránh sự bay hơi.
5. Sản phẩm phản ứng có thể có kết tủa màu trắng. Kết tủa là magie pyrophosphat được tạo ra bởi các ion pyrophosphate và magiê tự do trong dung dịch phản ứng không ảnh hưởng đến các thí nghiệm tiếp theo. Nếu bạn muốn loại bỏ nó, bạn có thể thêm một ít EDTA. Nếu việc thêm EDTA ảnh hưởng đến các thí nghiệm tiếp theo, phần chất lỏng nổi cũng có thể được thu hồi bằng cách ly tâm.
6. Bảo quản thuốc thử và bình chứa không bị nhiễm RNase.
Trộn dung dịch thành phần, ly tâm nhanh đến đáy ống và ủ ở 37°C trong 2 giờ. Nếu độ dài bản sao nhỏ hơn 100 nt, kéo dài thời gian phản ứng lên 4-8 giờ.
Điều trị D.DNase I (tùy chọn)Sau khi phản ứng hoàn tất, thêm 2 μL DNase I (không chứa RNase) vào mỗi ống và ủ ở 37°C trong 15 phút để loại bỏ DNA khuôn mẫu.
Những câu hỏi thường gặp
- Năng suất bản sao thấp
Chất lượng mẫu có liên quan chặt chẽ đến năng suất. Năng suất của nhóm thực nghiệm thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng. Các lý do có thể là:
- Mẫu thử nghiệm chứa các thành phần ức chế;
- Có thể mẫu có vấn đề gì đó.
Gợi ý: ① Làm sạch lại mẫu; ② Xác định định lượng mẫu và tính toàn vẹn của mẫu; ③ Kéo dài thời gian phản ứng; ④ Tăng lượng mẫu đầu vào; ⑤ Sử dụng các chất xúc tiến khác và các RNA polymerase khác.
- Năng suất thấp của bản sao ngắn
Các đoạn khuôn mẫu ngắn có thể ức chế phản ứng. Khi sản phẩm phiên mã nhỏ hơn 100 nt, nếu muốn tăng sản lượng, hãy kéo dài thời gian phản ứng lên 4-8 giờ hoặc tăng lượng khuôn mẫu lên 2 μg.
- Chiều dài phiên mã RNA là lớn hơn hơn mong đợi
Nếu kết quả điện di cho thấy dải sản phẩm lớn hơn kích thước mong đợi, có thể có những lý do sau: ① Khuôn plasmid có thể không được tuyến tính hóa hoàn toàn; ② Đầu 3' của chuỗi cảm biến có cấu trúc nổi bật; ③ RNA có cấu trúc thứ cấp chưa bị biến tính hoàn toàn.
Gợi ý: ①Kiểm tra xem khuôn mẫu đã được tuyến tính hóa hoàn toàn chưa và nếu cần, hãy thực hiện tuyến tính hóa bổ sung; ②Chọn một enzyme hạn chế thích hợp để tránh phần nhô ra ở đầu 3' hoặc sử dụng DNA polymerase Klenow Fragment/T4 để hoàn tất phiên mã trước khi tiến hành; ③Sử dụng gel biến tính để phát hiện các sản phẩm RNA.
- Chiều dài phiên mã RNA là nhỏ hơn hơn mong đợi
Nếu điện di cho thấy dải sản phẩm nhỏ hơn kích thước mong đợi, thì có thể có những lý do sau: là: ①Khuôn mẫu chứa một trình tự kết thúc tương tự như trình tự kết thúc của polymerase RNA T7; ②Hàm lượng GC của mẫu quá cao.
Gợi ý: ①Giảm nhiệt độ phản ứng (ví dụ, 30°C). Đôi khi việc giảm nhiệt độ có thể góp phần kéo dài thời gian phiên mã, nhưng có thể giảm năng suất. Hãy thử các cách khác RNA polymerase cho phiên mã; ②Nếu hàm lượng GC khuôn mẫu cao, thực hiện phản ứng ở 42℃ hoặc thêm SSB để tăng sản lượng và độ dài phiên mã.
- Đuôi điện di của sản phẩm phiên mã
Hiện tượng đuôi trong quá trình điện di có thể do: ① Nhiễm bẩn RNase trong quá trình vận hành thử nghiệm; ② Khuôn mẫu DNA bị nhiễm RNase.
Gợi ý: ①Sử dụng đầu pipet không chứa RNase và ống EP, đeo găng tay cao su và khẩu trang dùng một lần, và tất cả thuốc thử được chuẩn bị bằng H không chứa RNase2O. ②Làm sạch lại DNA khuôn mẫu.
Thông tin đặt hàng
| Tên sản phẩm | Số danh mục | Sđặc điểm kỹ thuật |
| 10623ES | 50/100/500T | |
| 10625ES | 10KU/100KU/2500KU/25MU | |
| 10620ES | 10U/100U/1000U | |
| 10621ES | 10KU/20KU/100KU/1MU | |
| 10614ES | 2KU/10KU/100KU | |
| 10612ES | 10KU/50KU/250KU | |
| 10611ES | 500/2000/10000U | |
| 12603ES | 24/96 T |