Mặc dù đạt được kết quả tốt trong đại dịch và cho thấy tiềm năng to lớn, công nghệ mRNA vẫn có một số hạn chế, chẳng hạn như thời gian biểu hiện ngắn và dịch mã protein hạn chế. Mặc dù các đặc điểm này có thể cung cấp một mức độ an toàn nhất định, nhưng chúng trở thành hạn chế đối với các liệu pháp như thay thế protein. Điều này đòi hỏi phải dùng liều lặp lại để duy trì mức độ biểu hiện protein, dẫn đến những rủi ro và thách thức mới như khả năng sinh miễn dịch và kháng thể trung hòa.
RNA tự khuếch đại (saRNA) có thể tạo ra phản ứng miễn dịch tương tự ở liều lượng nhỏ hơn hàng trăm hoặc thậm chí hàng nghìn lần so với mRNA thông thường. Liều lượng thấp hơn có nghĩa là chi phí sản xuất thấp hơn và việc tiêm ít thường xuyên hơn có thể làm giảm các tác dụng phụ độc hại tiềm ẩn từ mRNA và các vector phân phối. Hiện tại, một số ứng cử viên saRNA đã bước vào thử nghiệm lâm sàng trên toàn thế giới. Các công ty lớn như BioNTech đang tích cực phát triển các đường ống công nghệ saRNA.
Mặc dù saRNA mang lại lợi thế đáng kể về chi phí và an toàn, cấu trúc độc đáo của nó lại đặt ra những thách thức mới trong sản xuất. Phân tử saRNA, kết hợp trình tự mã hóa RNA polymerase với trình tự protein mục tiêu, lớn hơn nhiều (~10kb) và phức tạp hơn (chứa nhiều cấu trúc thứ cấp hơn) so với mRNA thông thường. Điều này làm tăng đáng kể độ khó của các phản ứng phiên mã trong ống nghiệm, làm giảm năng suất và độ tinh khiết của sản xuất saRNA. Do đó, sản xuất saRNA đòi hỏi các tiêu chuẩn cao hơn trong quá trình tổng hợp, tách và tinh chế.
Sắc ký ái lực, một phương pháp được sử dụng để tách và tinh chế, có những vấn đề như năng suất và tính toàn vẹn của sản phẩm mục tiêu thấp. Việc kết hợp nhiều phương pháp tinh chế sắc ký (ví dụ, thêm sắc ký xenlulo, sắc ký pha ngược kỵ nước) rất cồng kềnh, đưa vào tạp chất mới, có tỷ lệ thu hồi thấp và tốn kém. Ngoài ra, hệ thống phản ứng IVT được sử dụng để sản xuất quy mô lớn được tối ưu hóa từ các hệ thống phù hợp để tổng hợp trình tự axit nucleic 100nt, khiến nó không phù hợp với saRNA, có kích thước vượt quá 10kb. Điều này đòi hỏi phải tối ưu hóa các hệ thống phản ứng IVT hiện có. Hiện tại, các phương pháp tinh chế mRNA thông thường không thể đáp ứng các yêu cầu về chất lượng chất lỏng thô công nghiệp. Do đó, có một nhu cầu cấp thiết là phải phát triển và tối ưu hóa một quy trình tách và tinh chế cấp công nghiệp hoàn chỉnh và hiệu quả để tự khuếch đại RNA.
Tối ưu hóa sản xuất công nghiệp và phương pháp tinh chế
Để phát triển một hệ thống sản xuất công nghiệp cho mRNA tự khuếch đại (saRNA), điều cần thiết là trước tiên phải tối ưu hóa các loại ion đệm và các thành phần trong hệ thống đồng phiên mã IVT ở quy mô nhỏ. Điều này cũng bao gồm việc tinh chỉnh tỷ lệ đệm sắc ký và rửa mẫu cho các quy trình tinh chế hạ nguồn. Sau đó, các điều kiện được tối ưu hóa này có thể được mở rộng lên quy mô sản xuất lớn để xác minh xem hệ thống có thể tăng hiệu quả năng lực sản xuất và cải thiện chất lượng của sản phẩm thô hay không.
Hệ thống phản ứng thêm mũ đồng phiên mã
Trong hệ thống phản ứng thêm mũ đồng phiên mã, các thành phần đệm T7 bao gồm 400 mM HEPES, 20 mM spermidine, 100 mM DTT và muối Mg2+.
Đệm T7 - Loại muối ion Magie
Loại muối ion magie được sử dụng ảnh hưởng đến năng suất và tính toàn vẹn của sản phẩm saRNA mục tiêu.
- Đối với quá trình tổng hợp đồng phiên mã quy mô nhỏ của 1mg mRNA, sử dụng Mg(OAc)2 làm muối Mg2+ mang lại năng suất và tính toàn vẹn tốt nhất, với các giá trị lần lượt là 100,5µg và 62,9%.
- Ngược lại, sử dụng các muối ion magiê khác như MgCl2 và MgSO4 làm giảm năng suất khoảng 25-50% và độ nguyên vẹn khoảng 10%, làm giảm đáng kể cả năng suất và độ nguyên vẹn.
Đệm T7 - Nồng độ ion Magie
Nồng độ tối ưu của ion magie axetat (30-50 mM) giúp tăng năng suất và tính toàn vẹn của saRNA mục tiêu, với kết quả tốt nhất ở mức 35 mM.
- Ở nồng độ ion magie axetat là 30-50mM, sản lượng saRNA đạt 88,5-100,5µg và độ toàn vẹn là 58,6-62,9%, cho kết quả tốt.
- Ở nồng độ 35mM, năng suất và độ toàn vẹn đạt mức cao nhất, lần lượt đạt 100,5µg và 62,9%.
Đệm T7 - Muối ion Magie kết hợp với các muối khác
Việc thêm các loại muối khác vào dung dịch đệm T7 có thể cải thiện đáng kể năng suất và tính toàn vẹn của sản phẩm mục tiêu.
- Đệm cơ bản T7 bao gồm 400 mM HEPES, 20 mM spermidine, 100 mM DTT và muối Mg2+, tạo ra năng suất và tính toàn vẹn lần lượt là 100,5µg và 62,9%.
- Việc bổ sung muối thứ hai, NaOAc, giúp tăng thêm năng suất và tính toàn vẹn: năng suất tăng 20-110µg và tính toàn vẹn được cải thiện khoảng 2-8%.
Đệm T7 - Nồng độ muối kết hợp
Khi thành phần muối thứ hai NaOAc (Na+) ở nồng độ 5-30 mM, năng suất và tính toàn vẹn của saRNA mục tiêu được cải thiện đáng kể, với nồng độ tốt nhất là 15 mM.
- Ở nồng độ Na+ từ 3-30mM, sản lượng saRNA đạt 120-210µg, độ toàn vẹn đạt 64,4-70,2%, cho kết quả tốt.
- Ở nồng độ Na+ là 15mM, năng suất và tính toàn vẹn đạt mức cao nhất, lần lượt đạt 210µg và 70,2%.
Phương pháp thanh lọc đơn
Trong quá trình sản xuất và tinh chế saRNA quy mô nhỏ (<50mg), sử dụng các phương pháp tinh chế khác nhau có thể làm giảm đáng kể hàm lượng dsRNA và dư lượng protein, đảm bảo năng suất cao, hiệu quả đóng nắp và tính toàn vẹn của sản phẩm. Hiệu quả của các phương pháp tinh chế từ tốt nhất đến tệ nhất là: sắc ký ái lực > kết tủa liti clorua > siêu lọc, sắc ký xenlulo.
-
Sắc ký ái lực
Đối với sản xuất mRNA quy mô lớn, sắc ký được ưa chuộng hơn. Các tùy chọn bao gồm sắc ký pha đảo ngược, trao đổi ion, kỵ nước và sắc ký ái lực, mỗi loại đều có ưu và nhược điểm riêng. Sắc ký ái lực, thường được sử dụng để thu thập poly(A) mRNA, cung cấp khả năng mở rộng và các giải pháp nền tảng với tỷ lệ thu hồi >90%.
Các đặc điểm cấu trúc chính của mRNA, mũ 5' và đuôi poly(A) 3', tạo điều kiện cho quá trình tinh chế. Sắc ký ái lực, tương tự như quá trình tinh chế hạt từ, sử dụng các hạt liên kết dT để thu giữ mRNA đuôi poly(A). Điều kiện muối cao che chắn các điện tích âm, cho phép liên kết thông qua liên kết hydro AT và mRNA được rửa giải dưới độ pH trung tính nhẹ và độ dẫn điện thấp.
Sắc ký ái lực đối với RNA liên quan đến "liên kết muối cao, rửa giải muối thấp". Thành phần đệm, kích thước phân tử, nhiệt độ và nồng độ mẫu ảnh hưởng đáng kể đến quá trình này. Việc lựa chọn loại muối và nồng độ tối ưu thông qua thử nghiệm là điều cần thiết để tinh chế hiệu quả.
Tinh chế: Phương pháp này mang lại tính toàn vẹn của sản phẩm cao nhất (80,3%), hàm lượng dsRNA thấp nhất (0,01µg/mg), hiệu quả đóng nắp cao nhất (96,4%) và ít cặn protein nhất (1,20µg/mg), với năng suất 136µg và tỷ lệ thu hồi là 65%, khiến đây trở thành phương pháp tốt nhất về độ tinh khiết và chất lượng sản phẩm.
-
Các phương pháp thanh lọc khác:
Kết tủa Liti clorua
Nguyên lý tinh chế mRNA bằng LiCl là lithium có thể làm giảm lực đẩy tĩnh điện giữa các phân tử ở độ pH nhất định, cho phép kết tủa RNA hiệu quả.Sau đó, kết tủa được tách ra bằng cách ly tâm, hòa tan để thu được mẫu RNA tinh khiết. Kết tủa LiCl đơn giản, nhanh chóng, hiệu quả đối với mRNA có nhiều kích cỡ khác nhau và tạo ra các sản phẩm có độ tinh khiết cao. Tuy nhiên, các ion lithium còn lại có thể ức chế mRNA. Nên sử dụng kết tủa LiCl cho các dung dịch chứa ít nhất 400 µg/ml RNA để đảm bảo hiệu quả tinh chế. Phương pháp này cho năng suất cao (210µg), nhưng độ toàn vẹn của sản phẩm chỉ đạt 70,2%, làm giảm đáng kể chất lượng sản phẩm. Không phù hợp để sản xuất quy mô lớn.
Phương pháp hạt từ tính:
Hạt từ là những hạt nhỏ chuyển động theo hướng dưới từ trường, thường bao gồm lõi oxit sắt và lớp phủ bên ngoài. Tinh chế hạt từ là một kỹ thuật sinh học phân tử phổ biến để làm giàu nhanh chóng và hiệu quả các phân tử mRNA từ hỗn hợp. Các hạt từ chức năng khác nhau có các nhóm chức năng bề mặt khác nhau (ví dụ, hydroxyl, carboxyl, Oligo(dT), streptavidin) để tinh chế các phân tử sinh học khác nhau.
Hạt từ tính cacboxylated có thể tinh chế hiệu quả các axit nucleic, với các phân tử mRNA liên kết thông qua các tương tác tĩnh điện trong điều kiện axit. Điều chỉnh các điều kiện cho phép liên kết và giải phóng mRNA có chọn lọc. Các mRNA dài hơn với nhiều nhóm phosphate tích điện âm tiếp xúc hơn liên kết dễ dàng hơn với các hạt. Đối với các mRNA ngắn hơn, có thể cần khối lượng hạt lớn hơn. Các hạt từ tính liên kết với oligo(dT), tương tự như sắc ký ái lực, sử dụng liên kết cụ thể giữa đuôi poly(A) của mRNA và Oligo(dT) của hạt.
Siêu lọc
Phương pháp này tạo ra độ toàn vẹn của saRNA thấp nhất, thấp hơn khoảng 8% so với sắc ký ái lực, với lượng protein còn lại cao nhất (4,58µg/mg).
Sắc ký Cellulose
Phương pháp này đạt được hàm lượng dsRNA thấp (0,009µg/mg) và tỷ lệ đóng nắp cao (96,4%). Tuy nhiên, lượng protein còn lại cao hơn một chút (5,30µg/mg), với tỷ lệ thu hồi chỉ 57% và năng suất là 120µg, cả hai đều thấp hơn đáng kể so với hàm lượng đạt được bằng sắc ký ái lực (lần lượt là khoảng 10% và 16µg).
Quá trình thanh lọc
Thành phần đệm sắc ký - Bổ sung chất khử
Việc thêm chất khử vào đệm sắc ký trong quá trình tinh chế có thể cải thiện đáng kể tính toàn vẹn của sản phẩm, tỷ lệ thu hồi và hiệu quả đóng nắp, đồng thời giảm mức dsRNA sản phẩm phụ và dư lượng protein so với việc không thêm chất khử.
- Không có chất khử:
- Năng suất: 136µg
- Tỷ lệ phục hồi: 65%
- Tính chính trực: 80,3%
- dsRNA: 0,01µg/mg
- Hiệu suất đóng nắp: 96,4%
- Dư lượng protein: 1,20µg/mg
- Độ tinh khiết và chất lượng sản phẩm tốt.
- Với chất khử (TCPE, DTT, β-mercaptoethanol):
- Năng suất tăng 10-40µg
- Tỷ lệ phục hồi tăng 5-18%
- Tính toàn vẹn được cải thiện khoảng 1-5%
- Hiệu suất đóng nắp: 96,4%
- dsRNA: thấp tới 0,005µg/mg
- Dư lượng protein: thấp tới 0,20µg/mg
- Cải thiện đáng kể độ tinh khiết và chất lượng sản phẩm.
Thành phần đệm sắc ký - Các loại chất khử
Các loại chất khử khác nhau được thêm vào đệm sắc ký có thể cải thiện thêm tính toàn vẹn của sản phẩm, tỷ lệ thu hồi và hiệu quả đóng nắp, đồng thời giảm dsRNA và dư lượng protein. TCPE được phát hiện là chất khử hiệu quả nhất.
- Với TCPE:
- Năng suất: 175µg
- Tỷ lệ phục hồi: 83%
- Chính trực: 85,2%
- dsRNA: 0,005µg/mg
- Hiệu suất đóng nắp: 96,4%
- Dư lượng protein: 0,20µg/mg
- Độ tinh khiết và chất lượng sản phẩm tuyệt vời.
Thành phần đệm sắc ký - Nồng độ chất khử
Thêm chất khử ở nồng độ 5-15 mM trong dung dịch đệm sắc ký có thể cải thiện đáng kể tính toàn vẹn của sản phẩm, tỷ lệ thu hồi và hiệu quả đóng nắp, đồng thời giảm dsRNA và dư lượng protein. Nồng độ tối ưu là 10 mM.
- Thêm 5-15mM TCPE:
- Năng suất: 160-178µg
- Tỷ lệ phục hồi: 76-85%
- Tính toàn vẹn: khoảng 85%
- dsRNA: 0,002-0,005µg/mg
- Hiệu suất đóng nắp: 96,4%
- Dư lượng protein: 0,20-0,52µg/mg
- Độ tinh khiết và chất lượng sản phẩm tốt.
- Với TCPE 10mM:
- Năng suất: 178µg
- Tỷ lệ phục hồi: 85%
- Chính trực: 85,4%
- dsRNA: 0,002µg/mg
- Hiệu suất đóng nắp: 96,4%
- Dư lượng protein: 0,20µg/mg
- Độ tinh khiết và chất lượng sản phẩm tối ưu.
Tỷ lệ giặt
Kiểm soát tỷ lệ đệm sắc ký với nước tiêm trong quá trình rửa (10-25):(75-90) có thể cải thiện đáng kể tính toàn vẹn của sản phẩm, tỷ lệ thu hồi và hiệu quả đóng nắp, đồng thời giảm dsRNA và dư lượng protein. Tỷ lệ tối ưu là 15:85.
- Tỷ lệ (10-25):(75-90):
- Năng suất: 150-179µg
- Tỷ lệ phục hồi: 71-85%
- Tính chính trực: 84-90%
- dsRNA: 0,002-0,006µg/mg
- Hiệu suất đóng nắp: 96,4%
- Dư lượng protein: khoảng 0,20µg/mg
- Độ tinh khiết và chất lượng sản phẩm tốt.
- Với tỷ lệ 15:85:
- Năng suất: 179µg
- Tỷ lệ phục hồi: 85%
- Tính chính trực: 90.0%
- dsRNA: 0,002µg/mg
- Hiệu suất đóng nắp: 96,4%
- Dư lượng protein: 0,20µg/mg
- Độ tinh khiết và chất lượng sản phẩm tối ưu.
Phương pháp thanh lọc kết hợp
Sử dụng kết hợp các phương pháp tinh chế khác nhau có thể làm giảm thêm mức dsRNA và protein còn sót lại trong sản phẩm, nâng cao chất lượng tổng thể. Thứ tự ưu tiên của các phương pháp tinh chế là: sắc ký ái lực > siêu lọc + sắc ký ái lực > sắc ký ái lực + sắc ký cellulose > sắc ký cellulose + siêu lọc. Chỉ riêng sắc ký ái lực cung cấp kết quả tốt nhất.
-
Sắc ký ái lực đơn thuần:
- Năng suất: 179µg
- Tỷ lệ phục hồi: 85%
- Tính chính trực: 90.0%
- dsRNA: 0,002µg/mg
- Hiệu suất đóng nắp: 96,4%
- Dư lượng protein: 0,20µg/mg
- Sản phẩm có độ tinh khiết và chất lượng cao nhất.
-
Siêu lọc + Sắc ký ái lực:
- Năng suất: 170µg (ít hơn 9µg so với sắc ký ái lực đơn thuần)
- Tỷ lệ thu hồi: 81% (ít hơn 4% so với sắc ký ái lực đơn thuần)
- Tính chính trực: 88,5%
- dsRNA: 0,0015µg/mg
- Dư lượng protein: 0,18µg/mg
- Giảm nhẹ dsRNA và protein còn lại so với sắc ký ái lực đơn thuần, nhưng giảm đáng kể về năng suất và tỷ lệ thu hồi. Phương pháp này phức tạp hơn, tăng gấp đôi thời gian tinh chế và tăng chi phí.
-
Sắc ký ái lực + Sắc ký xenluloza / Sắc ký xenluloza + Siêu lọc:
- dsRNA: thấp hơn 0,005µg/mg so với phương pháp đơn lẻ
- Năng suất: ít hơn 60-100µg
- Tỷ lệ phục hồi: thấp hơn 30-40%
- Số bậc thang tăng lên sẽ làm tăng chi phí nhân công và vật liệu.
Sản xuất quy mô lớn
Trong sản xuất quy mô lớn, sử dụng sắc ký ái lực, sắc ký ái lực kết hợp với sắc ký xenluloza hoặc siêu lọc kết hợp với sắc ký ái lực, sản lượng mRNA tự khuếch đại tăng đáng kể lên 140-185µg, với tỷ lệ thu hồi là 67-88%. Tính toàn vẹn của sản phẩm là 93-94%, hàm lượng dsRNA được kiểm soát trong khoảng 0,0018-0,0020µg/mg, hiệu suất đóng nắp đạt 96,1-96,4% và dư lượng protein được giữ trong khoảng 0,04-0,05µg/mg. Điều này chứng tỏ khả năng mở rộng quy mô và hiệu quả tốt cho sản xuất quy mô lớn.
Thẩm quyền giải quyết:
[8] Phương pháp sản xuất công nghiệp và tách tinh chế mRNA tự khuếch đại dạng lỏng thô và ứng dụng của nó [P]. Bằng sáng chế: CN118048418A. 2024.05.17.
Thông tin đặt hàng