Sự tiến hóa và tầm quan trọng của cấu trúc nắp trong công nghệ mRNA

Cấu trúc Cap là thành phần thiết yếu trong quá trình phát triển vắc-xin mRNA và liệu pháp điều trị. Công nghệ mRNA tổng hợp dựa vào Cap1 để tăng cường tính ổn định, hiệu quả dịch mã và giảm khả năng nhận diện miễn dịch bẩm sinh của mRNA bởi các thụ thể giống toll (TLR) và các cảm biến miễn dịch khác, giảm thiểu sự kích hoạt miễn dịch không mong muốn. Điều này ngăn ngừa các phản ứng viêm không mong muốn, do đó cải thiện tính ổn định và hiệu quả của mRNA điều trị trong tế bào người.

Khám phá sớm và cấu trúc Cap0

Vào giữa những năm 1970, nghiên cứu về mRNA của sinh vật nhân chuẩn đã phát hiện ra một cấu trúc đầu cuối 5' hiện được gọi là Cap0, trong đó mũ N7-methylguanosine (m7G) được gắn vào nucleotide đầu tiên ở đầu 5'. Sự biến đổi này được phát hiện là bảo vệ mRNA khỏi sự phân hủy của exonuclease, hỗ trợ xuất khẩu nhân và thúc đẩy sự nhận dạng của ribosome để bắt đầu dịch mã. Cap0 là cấu trúc mũ đầu tiên được mô tả, với quá trình methyl hóa của nó chỉ giới hạn ở chính mũ guanosine. Việc phát hiện ra mũ 5' này và các chức năng của nó đã đánh dấu một bước đột phá đáng kể trong việc hiểu các mũ mRNA của sinh vật nhân chuẩn và vai trò của chúng trong các sửa đổi mRNA.

Cap0 Structure

Sự xuất hiện của Cap1

Cấu trúc Cap1, một đặc điểm quan trọng của mRNA nhân chuẩn, đóng vai trò then chốt trong sự ổn định của mRNA, quá trình dịch mã và nhận diện miễn dịch. Cấu trúc mũ mRNA, bao gồm N7-methylguanosine (m7G) liên kết với nucleotide đầu tiên thông qua liên kết triphosphate 5'-5', phát triển từ các nghiên cứu ban đầu về các sửa đổi sau phiên mã mRNA nhân chuẩn vào những năm 1970.

Cap1 Structure

Cấu trúc của mRNA có mũ đầu 5′.【1】 Các nghiên cứu sâu hơn cho thấy rằng ở hầu hết các mRNA của sinh vật nhân chuẩn, nucleotide đầu tiên theo sau mũ (vị trí +1) cũng được methyl hóa ở vị trí 2'-O của ribose, một quá trình được gọi là methyl hóa 2'-O. Khám phá này, được gọi là cấu trúc Cap1 (m7GpppNm), đã bổ sung thêm một lớp ý nghĩa chức năng nữa vào các sửa đổi mRNA. Sửa đổi Cap1 được phát hiện là tinh chỉnh độ ổn định của mRNA và ngăn ngừa sự nhận dạng miễn dịch của hệ thống miễn dịch bẩm sinh, đặc biệt là ở các tế bào động vật có vú, nơi nó giúp trốn tránh sự nhận dạng của các thụ thể nhận dạng mẫu như RIG-I, TLR và MDA5【2】. Điều này rất quan trọng đối với cả quá trình chuyển hóa mRNA và sự tiến bộ của các công nghệ dựa trên mRNA, bao gồm các ứng dụng tiêm chủng mRNA và liệu pháp gen.

Những thách thức kỹ thuật trong ngành công nghiệp mRNA và các giải pháp hiện tại

Vẫn còn một số thách thức kỹ thuật trong việc ứng dụng rộng rãi và tối ưu hóa vắc-xin mRNA, bao gồm các vấn đề về mRNA liều cao, phản ứng miễn dịch, tính ổn định và khả năng phân phối. Một thách thức đáng kể trong ngành mRNA là nhu cầu về liều cao mRNA để tạo ra phản ứng miễn dịch mạnh mẽ. Điều này là do một số yếu tố:

Sự suy thoái nhanh chóng: mRNA vốn không ổn định và dễ bị phân hủy bởi các enzyme cắt mũ và ribonuclease (RNase) có trong các hệ thống sinh học.

Hiệu quả dịch thuật hạn chế: Hiệu quả mà mRNA được dịch thành protein có thể thay đổi, đòi hỏi lượng mRNA cao hơn để tạo ra đủ mức kháng nguyên cho phản ứng miễn dịch. Hiệu quả dịch liên quan đến ái lực của Cap1 và yếu tố khởi đầu dịch eIF4E.

Translation Initiation Complex

Sự hình thành phức hợp khởi đầu dịch mã cơ bản ở sinh vật nhân chuẩn.【3】

Tính sinh miễn dịch và phản ứng miễn dịch không mong muốn: Rào cản lớn thứ ba là phản ứng miễn dịch bẩm sinh có thể được kích hoạt bởi chính mRNA, đặc biệt là đối với dsRNA hoặc mRNA không đầy đủ. Mặc dù mong muốn có một mức độ kích hoạt miễn dịch nhất định để kích thích hệ thống miễn dịch thích ứng, nhưng việc kích hoạt quá mức có thể dẫn đến phản ứng viêm, có thể làm giảm hiệu quả của vắc-xin hoặc gây ra tác dụng phụ.

Lịch sử công nghệ đóng nắp

  1. Công nghệ đóng nắp bằng Enzym: Phương pháp đóng nắp bằng enzym, được giới thiệu vào những ngày đầu của nghiên cứu mRNA, bao gồm việc sử dụng các enzym đóng nắp như guanylyltransferase và methyltransferase để thêm một nắp 5' tự nhiên sau phiên mã. Phương pháp này đảm bảo độ trung thực cao và hiệu quả đóng nắp trong quá trình dịch mRNA, đặc biệt là đối với các ứng dụng điều trị.

  2. Các loại nắp tổng hợp tương tự (những năm 1980-2000): Các nhà nghiên cứu đã phát triển các chất tương tự mũ tổng hợp để tổng hợp mRNA có mũ trong ống nghiệm, giúp nghiên cứu chức năng mRNA và biểu hiện gen. Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) là chất tương tự mũ tổng hợp được thiết kế để ngăn ngừa sự kết hợp mũ không chính xác trong quá trình tổng hợp mRNA, cải thiện hiệu quả dịch mã của mRNA cho vắc-xin và liệu pháp gen. Tuy nhiên, hiệu quả và năng suất của mũ ARCA thấp.

  3. Công nghệ Cap1 (những năm 2010): Phương pháp mũ đồng phiên mã Cap1 giúp đơn giản hóa quy trình bằng cách kết hợp mũ trực tiếp trong quá trình tổng hợp mRNA. Phương pháp này tăng cường hiệu quả và tạo ra tỷ lệ phần trăm cao mRNA được mũ chính xác, khiến nó trở nên lý tưởng cho các ứng dụng điều trị quy mô lớn như vắc-xin mRNA.

Hiện nay, công nghệ đóng nắp bằng enzym đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các liệu pháp dựa trên mRNA, bao gồm vắc-xin COVID-19, đảm bảo tính ổn định và dịch mã hiệu quả của mRNA điều trị.

So sánh nắp Enzym thế hệ tiếp theo LZCap Capping và phương pháp Capping thế hệ đầu tiên (ARCA)


Phát triển các loại Cap Analog thế hệ tiếp theo

Chúng tôi hướng đến mục tiêu phát triển các chất tương tự mũ có khả năng kháng enzyme cắt mũ, ái lực cao với eIF4E để cải thiện hiệu quả dịch mã và giảm khả năng sinh miễn dịch. Những tiến bộ này rất quan trọng để tăng cường hiệu quả của các liệu pháp dựa trên mRNA, bao gồm các phương pháp điều trị chống ung thư và các ứng dụng liệu pháp gen.

Thiết kế LZCap

Khi thiết kế LZCap, chúng tôi chủ yếu tập trung vào việc tạo ra một chất tương tự nắp có ái lực cao với eIF4E. Các enzyme có khả năng nhận dạng chất nền tương đối "đặc hiệu". Do đó, khi thiết kế một cấu trúc nắp mới, chúng tôi cố gắng duy trì sự tương đồng với các cấu trúc tự nhiên/đã biết càng nhiều càng tốt. Cấu trúc tự nhiên có ribose 3' OH, có thể được sửa đổi (ví dụ: metyl hóa). Dựa trên cân nhắc này, chúng tôi đã chọn thêm một cacbon ở vị trí 3' để tạo sự mới lạ, tiếp theo là NH để mô phỏng liên kết hydro của OH, và sau đó là một nhóm acetyl để giảm tính bazơ của NH và tăng cường khả năng liên kết hydro của nó. Hoạt động của LZCap tốt hơn nắp tự nhiên đã metyl hóa, có thể là do liên kết hydro tăng lên. So với các nhóm methyl và methoxy, nhóm acetyl amino cũng có thể làm tăng tương tác van der Waals giữa chất nền (nắp) và yếu tố khởi đầu (enzyme).

Độ ổn định của nhóm Acetyl Amino

Nhóm acetyl amino đã đủ ổn định. Nó ổn định hơn nhiều so với vị trí 7-methyl hóa và liên kết phosphodiester, là những phần kém ổn định nhất của mũ.

Hiệu suất và hiệu suất đóng nắp của LZCap

Với nắp LZCap AG(3'Acm), hiệu suất đóng nắp mRNA luciferase đạt khoảng 97,59% và có thể thu được tới 200 μg mRNA có nắp với 1 μg khuôn mẫu DNA trong phản ứng phiên mã in vitro (IVT) tiêu chuẩn với T7 RNA polymerase. Độ tinh khiết của mRNA đạt tới 99% sau khi kết tủa LiCl đơn giản. Hiệu suất đóng nắp và năng suất cao này khiến LZCap trở thành một lựa chọn hấp dẫn cho nhiều ứng dụng khác nhau, bao gồm sản xuất protein và liệu pháp gen.

Cấu trúc Cap là thành phần thiết yếu trong quá trình phát triển vắc-xin và liệu pháp mRNA.Công nghệ mRNA tổng hợp dựa vào Cap1 để tăng cường tính ổn định, hiệu quả dịch mã và giảm khả năng nhận diện miễn dịch bẩm sinh của mRNA bởi các thụ thể giống toll (TLR) và các cảm biến miễn dịch khác, giảm thiểu sự kích hoạt miễn dịch không mong muốn. Điều này ngăn ngừa các phản ứng viêm không mong muốn, do đó cải thiện tính ổn định và hiệu quả của mRNA điều trị trong tế bào người.

Sản phẩm

Mũ lưỡi trai TẠI SAO (3'-ỒTôi-7mG)

LZCap AG(3'Acm)

TẠI SAO (không giới hạn)

sản lượng mRNA (mg)

164

173

200

Phân tích MS về hiệu quả đóng nắp của mRNA Luciferase LZCapped với phương pháp dựa trên RNAse H. Hiệu quả đóng nắp khoảng 97,59%,

Sự ổn định của mRNA đối với enzyme cắt mũ như thế nào?

mRNA có LZCap AG(3'Acm) và LZCap AG M6 (3'Acm) cho thấy khả năng kháng cao hơn đối với enzyme decapping (NEB). Cần lưu ý rằng CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) cũng kháng với enzyme decapping, nhưng Cap AG thông thường (3'-OMe-7mG) không cho thấy khả năng kháng.

Độ liên kết của LZCap với eIF4E như thế nào?

Biểu hiện protein của mRNA có mũ LZCap AG(3'Acm) như thế nào?

Biểu hiện của mRNA luciferase có mũ LZCap AG(3'Acm) cao hơn đáng kể so với mRNA có mũ Cap1 tương tự (3'-OMe-7mG) trong các dòng tế bào khác nhau* (3T3-L1，Hela，JAWs， HEK293T và Huh7)，Thí nghiệm lặp lại 130 lần cho thấy biểu hiện mRNA luciferase có mũ LZCap AG(3'Acm) cao hơn trung bình khoảng 1,5 lần so với mRNA có mũ (3'-OMe-7mG). Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy ở chuột. Mức độ biểu hiện protein có thể thay đổi đôi chút tùy theo trình tự mRNA khác nhau.

Bạn có thêm dữ liệu về động vật không?

Hiệu quả biểu hiện của LZCap AG(3'Acm) hoặc LZCap AG(3'FMom) được giới hạn

mRNA mã hóa GLuc biểu hiện cao hơn trong cơ thể sống so với mRNA có mũ CapAG (3'-OMe-7mG) ở Khỉ Cynomolgus và Lợn.

Thế còn khả năng sinh miễn dịch bẩm sinh của mRNA có gắn LZCap AG thì sao?

mRNA có mũ LZCapAG (3'Acm) cho thấy khả năng sinh miễn dịch bẩm sinh thấp. TLR8, TLR7, IL-1A và B đóng vai trò quan trọng trong phản ứng miễn dịch do RNA không có mũ gây ra. Các nghiên cứu in vivo về phân tích khả năng sinh miễn dịch của mRNA có mũ LZCap cho thấy RNA không có mũ gây ra những thay đổi đáng kể ở mức độ phiên mã của các yếu tố liên quan đến miễn dịch ở chuột. Cả mRNA có mũ LZCap và 3'-OMe-7mG đều cho thấy mức độ phiên mã yếu tố miễn dịch thấp tương tự ở chuột sau một lần tiêm RNA kích thích.

Bạn đã thực hiện thử nghiệm an toàn nào chưa?

Có, chúng tôi đã thực hiện Thử nghiệm độc tính tế bào, Nghiên cứu ức chế polymerase ở người và Thử nghiệm Ames.

  1. Không có hoặc có rất ít độc tính tế bào được quan sát thấy đối với monome nucleoside của 3'-Acm-7mG（CC50＞10000nM）trong tế bào 293T, Huh7, MRC5, THP1 và U87MG.
  2. DNA polymerase của con người ( α , β , γ và Klenow) và các nghiên cứu ức chế hoạt động của RNA polymerase ty thể (hPOLRMT) cho thấy 3'-Acm-7mG TP không ức chế DNA hoặc RNA polymerase của con người.
  3. Xét nghiệm đột biến ngược vi khuẩn (Ames) phát hiện các biến đổi di truyền liên quan, cũng như các chất gây ung thư độc hại gen ở hầu hết các loài gặm nhấm và con người. Xét nghiệm Ames cho thấy 3'-Acm-7mG không có độc tính gen.

Sản phẩm này đã được cấp bằng sáng chế chưa?

Có. Bằng sáng chế đã được cấp tại Hoa Kỳ.

Thông tin đặt hàng

Tên sản phẩm Thông số kỹ thuật Số danh mục
LZCap AG(3'Acm)（ 100mM） 100μL, 1mL 10684ES
LZCap AU(3'Acm)（ 100mM) 100μL, 1mL 10685ES
LZCap GG(3'Acm)（ 100mM） 100μL, 1mL 10686ES
LZCap AG(3'Ma-Cy5)（ 25mM） 100μL, 1mL 10688ES
LZCap AG(3'Ma-Cy7)（ 25mM) 100μL, 1mL 10689ES
LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 mM) 100μL, 1mL 10687ES
LZCap (AG(3'Ma-Biotin) (25 mM) 100μL, 1mL Cuộc điều tra
LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) 100μL, 1mL Cuộc điều tra
LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) 100μL, 1mL TÔIyêu cầu
LZCap (AG(3'Acm) Firefly luc mRNA (1μg/μL) 100μL, 1mL TÔIyêu cầu
LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) 100μL, 1mL TÔIyêu cầu
LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) 100μL, 1mL TÔIyêu cầu
LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 μg/μL) 100μL, 1mL Cuộc điều tra
LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL) 100μL, 1mL TÔIyêu cầu
LZCap (AG(3'Acm) Gluc mRNA (1μg/μL) 100μL, 1mL TÔIyêu cầu

Thẩm quyền giải quyết:

  1. Cơ chế phân tử của quá trình đóng nắp và methyl hóa RNA của coronavirus, Virologica Sinica 31(1)
  1. Vắc-xin mRNA — kỷ nguyên mới trong ngành vắc-xin học. Nat. Rev. Thuốc. Discov. 17, 261–279 (2018).
  2. Khởi tạo dịch mã được điều chỉnh bởi protein liên kết RNA ở động vật có vú: Điều chế phức hợp khởi tạo dịch mã bằng các yếu tố hoạt động xuyên màng, tế bào 2021, 10(7), 1711

Cuộc điều tra