Bài viết này mô tả ứng dụng của Concanavalin A và liên kết cộng hóa trị của nó với hạt từ tính.
Phần 1. Concanavalin A
Hạt từ phủ Concanavalin A (hạt ConA), đúng như tên gọi, là hạt từ sinh học trong đó lectin thực vật Concanavalin A (ConA) được ghép với vật liệu nano siêu thuận từ. Sau đây là phần giới thiệu ngắn gọn về Hạt từ ConA.
Concanavalin A (ConA), một loại protein lectin thực vật không đặc hiệu với nhóm máu, là protein lectin thực vật đầu tiên được phân lập, tinh chế và kết tinh từ đậu mực (Canavalia ensiformis, Pennisetum maritimum) kể từ năm 1936.
ConA có 2 dạng chính tùy thuộc vào độ pH của dung dịch mà nó có mặt: homodimer α-2 hoặc homotetramer α-4 [2]. Trong điều kiện kiềm (pH>7,0), nó tồn tại dưới dạng tetramer (gồm bốn tiểu đơn vị có trọng lượng phân tử 26 kDa); trong điều kiện axit (pH 4,5-5,5), Con A phân ly thành cấu trúc dimeric hoạt hóa (52 kDa). Ngoài ra, chức năng của ConA bị ảnh hưởng bởi các cation hóa trị hai, ví dụ, khi không có ion kim loại (Ca2+ và Mn2+), cấu hình và chức năng liên kết glycoprotein của nó không thể thực hiện được[1].
Hình (1). Mô hình phân tử của (A) monome ConA, (B) dimer ConA, (C) tetramer ConA với mannose, glucose và các ion kim loại.
Phần 2. Hạt cườm
Hạt từ sinh học là một loại vi cầu từ có kích thước hạt nanomet, được tạo thành từ các polyme và các hạt nano từ vô cơ. Hạt từ có thể được phân loại thành ba loại chính theo cấu trúc của chúng: cấu trúc kiểu lõi-vỏ, cấu trúc kiểu bánh sandwich và cấu trúc kiểu khuếch tán. Vật liệu từ bao gồm bột sắt nguyên chất, sắt cacbonyl, quặng từ, orthoferrite và hợp kim sắt coban, và cộng sự.
Vật liệu nano từ tính, do có những hiệu ứng đặc biệt như hiệu ứng kích thước nhỏ, hiệu ứng bề mặt, hiệu ứng kích thước lượng tử, v.v., ở kích thước Fe3Ồ4 hạt nano có kích thước nhỏ hơn 30 nm, sự giao thoa của nhiễu loạn nhiệt bên trong các hạt nano là đáng kể và tại thời điểm này, các hạt nano này thể hiện một tính chất từ tính đặc biệt, tức là siêu thuận từ. Fe siêu thuận từ3Ồ4 Các hạt nano được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp sinh học do có các đặc tính chất lượng cao như không độc hại, tương thích sinh học tốt, đặc tính nhắm mục tiêu từ tính độc đáo và dễ tạo nhiệt trong từ trường xen kẽ.
Ngược lại, sự liên kết cộng hóa trị của ConA với các vi cầu để cố định các phân tử sinh học có những ưu điểm sau:
- Độ ổn định cao của liên kết cộng hóa trị giúp tái tạo được;
- Ligand ConA liên kết trên bề mặt của các hạt vi mô để tương tác với phân tử mục tiêu;
- Đặc tính động học của môi trường dung dịch, thích hợp cho thao tác thực nghiệm sinh học;
Phần 3. Ứng dụng của hạt từ ConA
Theo báo cáo trong tài liệu, các ứng dụng chính của hạt từ tính ConA được phân loại thành 3 trường hợp, đó là thực hiện tách màng tế bào chất, làm giàu glycoprotein và tách các khía cạnh tế bào bất động.
Ứng dụng I: Tách màng tế bào chất
Sử dụng hạt từ ConA bị ảnh hưởng bởi hoạt hóa của cation hóa trị hai, do đó nó tồn tại trong Ca2+ và Mg2+ môi trường dung dịch, sở hữu chức năng tương tác ái lực của đầu cuối α-D-mannosyl và α-D-glucosyl, được sử dụng trong quá trình tinh chế màng huyết tương, là một cách đơn giản và hiệu quả. Ví dụ, tách màng huyết tương của tế bào hoặc mô là một bước quan trọng để tiếp tục thu được protein màng huyết tương. ConA có khả năng liên kết các protein glycosyl hóa trên tế bào và nguyên tắc này có thể được sử dụng để thu được màng huyết tương có độ tinh khiết cao hơn. Các bước vận hành chính là: cố định ConA trên hạt từ tính bằng cách liên kết ConA biotin hóa với hạt từ tính streptavidin; ủ màng tế bào bằng hạt từ tính ConA trong 1 giờ; hấp phụ trên giá từ tính; rửa bằng TBS trong 5 lần; và rửa giải dung dịch màng tế bào chất bằng chất rửa giải[3].
Hình 2. Các bước tinh chế hạt từ ConA cho màng plasma
Ứng dụng II: Làm giàu Glycoprotein
ConA đặc hiệu với mannose và glucose và nhận diện mannose liên hợp α, là “oligosaccharide cốt lõi” của nhiều glycoprotein huyết thanh và màng tế bào. Do đó, nó có thể được sử dụng trong miễn dịch học để phân tách các phân tử glycosyl hóa như glycoprotein trong dịch phân hủy tế bào hoặc mô hoặc huyết thanh.
Một thủ tục quan trọng là bằng cách liên kết chéo các hạt nano từ tính aminosilan hóa (MNP) với ConA thông qua một chất liên kết hai chức năng, bis-N-hydroxysuccinimide linoleate (DSS), để thu được các hạt từ tính ConA; để chấm dứt sự liên kết không đặc hiệu của các hạt nano từ tính bằng cách sử dụng methoxyethylene glycol (MEG) và để thực hiện quá trình tách từ; để thêm chiết xuất của các protein màng tế bào được tiêu hóa bằng trypsin để ủ cả hai hạt từ tính ConA và các glycopeptide đã thu được, và cuối cùng để rửa giải các glycopeptide đã thu được và để thực hiện sấy chân không. Cả hai hạt từ tính ConA đều được ủ, các hạt từ tính ConA đã liên kết với glycoprotein được thu thập bằng giá từ tính, các hạt không phải glycopeptide được rửa sạch và cuối cùng các glycopeptide đã thu được được rửa giải và sấy chân không. Phương pháp này cho phép phân tích sâu các vị trí glycosyl hóa cụ thể của các protein liên quan đến khối u (ví dụ: EGFR)[4].
Hình 3. Các hạt nano siêu thuận từ được ghép nối với các lectin khác nhau
Ứng dụng III: Phân lập tế bào bất động
Việc sử dụng hạt từ ConA (hạt từ liên kết cộng hóa trị với Concanavalin A đồng hành có độ tinh khiết cao) để liên kết với glycoprotein trên màng tế bào hoặc màng nhân, do đó bắt giữ tế bào hoặc nhân, cho phép hình dung thao tác thực nghiệm trên số lượng nhỏ tế bào. Ví dụ, hạt từ ConA được sử dụng trong CUT&Tag và CUT&RUN [5] thí nghiệm, là những kỹ thuật mới được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của chromatin, và được cố định bằng cách liên kết các hạt từ tính ConA với các tế bào để quan sát hoạt động và tránh vấn đề mất tế bào do ly tâm.
So với công nghệ ChIP-seq truyền thống để nghiên cứu tương tác DNA-protein, CUT&Tag và CUT&RUN có những ưu điểm sau:
- Hạt từ tính ConA liên kết với glycoprotein màng tế bào để trực quan hóa hoạt động và nâng cao trải nghiệm vận hành thực nghiệm;
- Không cần ly tâm, chỉ cần các hạt từ tính ConA được hấp phụ trên giá từ tính để hoàn tất quá trình tách mẫu tế bào và dung dịch;
- Có thể vận hành chỉ với 10 cell, tránh nhu cầu sử dụng số lượng lớn mẫu cho ChIP-seq.
Hình 4. Sơ đồ quy trình thí nghiệm ChIP-seq, CUT&Tag, CUT RUN
Phần 4.
Hạt từ tính ConA, được phát triển bởi
1.Tính năng sản phẩm
- Sản xuất hàng loạt ổn định và khả năng tái tạo kết quả tốt hơn;
- Lưu trữ hiệu suất ổn định
- Hiệu suất bắt giữ tế bào >90%
2. Thông tin sản phẩm
| Mèo số | Mã số mèo #19810ES |
| Kích cỡ | 1mL/5mL/20mL |
| Màu sắc | Vàng nâu |
| Nồng độ hạt | 10mg/mL |
| Nội dung rắn | 9-11mg/mL |
| Kích thước hạt | 1 µm |
| Dung tích | 105 tế bào/µL hạt |
3. Dữ liệu hiệu suất sản phẩm
(1)Sự phân tán đơn
Trong cùng điều kiện xử lý và dưới độ phóng đại 10×/40×, các hạt ConA về cơ bản được phân tán đơn lẻ và không quan sát thấy hiện tượng kết tụ rõ ràng nào so với đối thủ cạnh tranh.
| | Hạt ConA của đối thủ cạnh tranh | |
Hình 5. Biểu đồ kết quả phân tán đơn
(2)Tác dụng của hạt ConA liên kết tế bào
Cùng một số lượng tế bào được ủ với các hạt trong cùng một khoảng thời gian và số lượng tế bào còn lại sau khi liên hợp các hạt ConA được tự động phát hiện dưới máy phân tích tế bào và kết quả cho thấy rằng
| Tế bào treo | Các tế bào còn lại sau khi liên kết với các hạt từ tính ConA cạnh tranh | Các tế bào còn lại sau khi liên kết |
Hình 6.Hình ảnh của tế bào liên kết hạt từ ConA
(3)Số lượng liên kết tế bào và khả năng lặp lại
Cả 10µL
Hình 7. Kết quả của hạt ConA liên kết số lượng tế bào và tỷ lệ bắt giữ
(4) Ổn định gia tốc
Phân phối ở mức 1 mL/ống. Các điều kiện bảo quản là: xử lý tăng tốc 4℃, 37℃ trong 2, 4, 7, 11 và 14 ngày và xử lý phá hủy ở -20℃ trong 1, 3, 6 và 8 ngày. Kết quả cho thấy trong cùng điều kiện thực nghiệm: tỷ lệ bắt giữ tế bào của các sản phẩm được bảo quản ở 4℃, xử lý tăng tốc ở 37℃ và xử lý phá hủy ở -20℃ là >95% và giá trị CV của ba nhóm bản sao trong mỗi điều kiện xử lý nằm trong phạm vi 1%, cho thấy khả năng tái tạo tốt.
Hình 8. Kết quả của tỷ lệ bắt giữ tế bào và độ lệch độ lặp lại của hạt ConA ở nhiệt độ và thời gian khác nhau
Thông tin đặt hàng
| 19810ES |