Bộ phân tích đoạn DNA còn sót lại của tế bào chủ HEK293 được thiết kế cho phân tích định lượng các đoạn DNA còn sót lại của HEK293 có nhiều độ dài khác nhau trong các sản phẩm trung gian, bán thành phẩm và sản phẩm cuối cùng của chế phẩm sinh học. Bộ dụng cụ này sử dụng nguyên lý đầu dò huỳnh quang qPCR để phát hiện nhanh chóng và cụ thể các đoạn DNA còn sót lại của HEK293 dưới và trên 200 cặp bazơ, với giới hạn định lượng thấp tới 10 fg/μL. Nó cũng bao gồm HEK293 DNA Control (tham chiếu định lượng DNA). Bộ dụng cụ này có thể được sử dụng kết hợp với các bộ dụng cụ chuẩn bị mẫu DNA còn sót lại dựa trên hạt từ tính của công ty (Mã số mèo #18461ES/18462ES).

Thông tin sản phẩm

Thành phần

Lưu trữ và vận chuyển:

1. Tất cả các thành phần được vận chuyển bằng đá khô và phải được bảo quản ở nhiệt độ từ -25°C đến -15°C khi nhận hàng. Thời hạn sử dụng là 2 năm. Các thành phần A và B1, B2, B3 và B4 phải được bảo quản tránh ánh sáng.

2. Khi nhận được, hãy kiểm tra xem có đủ cả 7 thành phần không và bảo quản ngay ở nhiệt độ khuyến nghị.

Các biện pháp phòng ngừa:

1. Sản phẩm này chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu.

2. Vì lý do an toàn và sức khỏe, vui lòng mặc áo khoác phòng thí nghiệm và găng tay dùng một lần trong quá trình thực hiện.

3. Trước khi sử dụng thuốc thử này, hãy đọc kỹ hướng dẫn sử dụng. Các thí nghiệm phải được tiến hành theo các quy trình chuẩn, bao gồm xử lý mẫu, chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và hút mẫu bằng pipet.

4. Mỗi thành phần phải được trộn đều bằng cách lắc nhẹ và ly tâm nhanh trước khi sử dụng.

Các nhạc cụ tương thích:

Bao gồm nhưng không giới hạn ở các nhạc cụ sau: Thermo Scientific: ABI 7500, ABI Quant Studio 5, ABI Step OnePlus, Bio-Rad: Mô-đun quang học CFX96, Công nghệ y tế Hongshi Thượng Hải: SLAN-96S

Hướng dẫn sử dụng

1. Pha loãng DNA HEK293 Kiểm soát Định lượng Tham chiếu và Chuẩn bị Đường cong Chuẩn

Bộ phân tích đoạn HEK293 bao gồm bốn đoạn khuếch đại có độ dài khác nhau: 82 bp, 133 bp, 227 bp và 515 bp. Khi thiết lập đường cong chuẩn, hãy thiết lập các đường cong riêng cho từng đoạn khuếch đại và tính toán lượng dư và phân phối tương đối của chúng dựa trên các đường cong chuẩn tương ứng.

Sử dụng đệm pha loãng DNA có trong bộ dụng cụ để thực hiện pha loãng theo gradient của HEK293 DNA Control Quantitative Reference. Nồng độ pha loãng phải là: 3 ng/μL, 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL và 30 fg/μL.

Chi tiết như sau

1). Đặt HEK293 DNA Control và DNA Dilution Buffer từ bộ dụng cụ vào đá để rã đông. Sau khi rã đông hoàn toàn, nhẹ nhàng vortex để trộn và ly tâm trong thời gian ngắn (10 giây) để thu thập dung dịch ở đáy ống.

2). Chuẩn bị sáu ống ly tâm sạch 1,5 mL và dán nhãn chúng là Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 và Std5.

3). Trong ống có nhãn Std0, thêm 90 μL đệm pha loãng DNA và 10 μL kiểm soát DNA HEK293 để đạt được nồng độ 3 ng/μL. Lắc nhẹ để trộn và ly tâm trong thời gian ngắn (10 giây). Nồng độ này có thể được chia nhỏ và bảo quản ở -20°C để sử dụng trong thời gian ngắn (tối đa 3 tháng). Tránh các chu kỳ đông lạnh-rã đông lặp lại.

4). Trong các ống có nhãn Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 và Std5, trước tiên thêm 90 μL đệm pha loãng DNA vào mỗi ống. Mỗi bước pha loãng phải được trộn nhẹ nhàng và ly tâm trong thời gian ngắn để đảm bảo tính đồng nhất. Sau đó thực hiện gradient pha loãng như sau:

Bảng 1: Pha loãng theo độ dốc chuẩn

* Đối với mỗi nồng độ, thực hiện 3 lần lặp lại. Thuốc thử này có thể thử nghiệm trong phạm vi tuyến tính từ 300 pg/μL đến 30 fg/μL. Nếu cần, phạm vi tuyến tính có thể được mở rộng hoặc thu hẹp một cách thích hợp.

** Để giảm các chu kỳ đông lạnh-tan băng lặp đi lặp lại và tránh nhiễm bẩn, nên chia nhỏ và lưu trữ định lượng DNA Schuẩn ở nhiệt độ -20°C cho lần sử dụng đầu tiên.

*** Dung dịch pha loãng DNA chưa sử dụng, đã rã đông có thể được bảo quản ở nhiệt độ 2-8°C trong tối đa 7 ngày. Nếu không sử dụng trong thời gian dài, hãy bảo quản ở nhiệt độ -20°C.

**** Để đảm bảo mẫu được trộn đều hoàn toàn, hãy lắc nhẹ từng dung dịch pha loãng trong khoảng 1 phút.

2. Chuẩn bị mẫu thử (TS)

Chuẩn bị mẫu thử TS theo thiết lập thí nghiệm như sau:

1) Lấy 100 μL mẫu thử và thêm vào ống ly tâm sạch 1,5 mL. Ghi nhãn là TS, thực hiện xử lý mẫu trước và chuẩn bị tôi thanh lọcvà các mẫu thử nghiệm.

2) Để đáp ứng yêu cầu phân tích bốn độ dài kéo dài khác nhau cùng một lúc, lượng mẫu thử đã xử lý trước phải ≥120 μL. Do đó, nên chuẩn bị 2 ống mẫu cho mỗi mẫu để xử lý trước, sau khi chiết xuất, trộn chúng lại với nhau để sử dụng.

3. Chuẩn bị Kiểm soát Chiết xuất Âm tính (NCS)

Chuẩn bị mẫu đối chứng chiết xuất âm tính NCS theo thiết lập thí nghiệm như sau:

1) Lấy 100 μL dung dịch mẫu nền (hoặc pha loãng DNA đệm) và thêm vào ống ly tâm sạch 1,5 mL. Ghi nhãn là NCS.

2) Thực hiện xử lý mẫu trước của NCS đối chứng âm tính cùng với lô mẫu thử và chuẩn bị dung dịch NCS đối chứng âm tính đã tinh khiết.

3) Để đáp ứng yêu cầu phân tích bốn độ dài kéo dài khác nhau cùng một lúc, lượng mẫu NCS đã xử lý trước phải ≥120 μL. Do đó, nên chuẩn bị 2 ống mẫu NCS để xử lý trước, sau khi chiết xuất, trộn chúng lại với nhau để sử dụng.

4. Chuẩn bị mẫu kiểm soát không có mẫu (NTC)

Chuẩn bị NTC kiểm soát không có mẫu theo thiết lập thí nghiệm như sau:

1) Không có Kiểm soát Mẫu (NTC) không yêu cầu mẫu tiền xử lý, và có thể được chuẩn bị bắt đầu từ giai đoạn phát hiện hàm lượng DNA còn sót lại bằng qPCR.

2) Đối với mỗi ống hoặc giếng, mẫu NTC bao gồm 20 μL hỗn hợp (tức là 15 μL HEK293 qPCR Mix + 5 μL HEK293 Primer & Probe Mix tương ứng) + 10 μL DNA Dilution Buffer. Nên chuẩn bị đủ cho 3 giếng sao chép.

5. Hệ thống phản ứng qPCR

Bàn 2. Hệ thống phản ứng vì đoạn 82 bp

Bàn 3. Hệ thống phản ứng cho 133 mảnh vỡ bp

Bàn 4. Hệ thống phản ứng cho 227 mảnh vỡ bp

Bàn 5. Hệ thống phản ứng cho 515 mảnh vỡ bp

* Để tính tổng lượng hỗn hợp cần thiết cho phản ứng này dựa trên số giếng:

Hỗn hợp = (Số giếng phản ứng + 2) × (15 + 5) μL (để tính đến lượng mất mát của 2 giếng). Thông thường, 3 giếng sao chép được chuẩn bị cho mỗi mẫu.

** Số giếng phản ứng = (5 giếng đường cong chuẩn nồng độ + 1 mẫu đối chứng không có khuôn mẫu (NTC) + 1 dung dịch đối chứng âm tính (NCS) + N mẫu thử nghiệm (TS)) × 3.

NTC (Không kiểm soát mẫu): Đệm pha loãng DNA

NCS (Dung dịch kiểm soát âm tính): Dung dịch nền mẫu hoặc đệm pha loãng DNA sau khi mẫu trước-sự đối đãi để thu được dung dịch tinh khiết, tức là NCS.

TS (Mẫu thử): Mẫu cần thử nghiệm.

***Sau khi phân phối mẫu và niêm phong các ống, ly tâm nhanh ở tốc độ thấp (10 giây) để thu thập chất lỏng từ thành ống xuống đáy. Sau đó, lắc xoáy ít nhất 5 giây để trộn đều. Sau đó, thực hiện ly tâm tốc độ thấp khác (10 giây). Nếu có bất kỳ bong bóng nào, hãy đảm bảo loại bỏ chúng.

Bảng 6: Bố trí tấm tham chiếu

Ví dụ này trình diễnlà quy trình phát hiện qPCR để phân tích các đoạn khuếch đại của DNA HEK293 còn sót lại.Các mẫu thử nghiệm bao gồm: 5 gradient nồng độ của đường cong chuẩn DNA HEK293, 1 mẫu thử nghiệm (TS), 1 dung dịch đối chứng âm tính (NCS) và 1 đối chứng không có khuôn mẫu (NTC). Khuyến cáo chạy 3 giếng lặp lại cho mỗi mẫu.

6. Các tham số chương trình khuếch đại (Tđây-Phương pháp từng bước) (Ví dụ sử dụng Thiết bị ABI 7500 qPCR, Phiên bản phần mềm 2.0)**

1) Tạo một chương trình trống mới và chọn "Định lượng tuyệt đối" làm mẫu phát hiện.

2) Đối với bốn độ dài đoạn khuếch đại khác nhau, hãy tạo các đầu dò phát hiện mới, đặt tên cho chúng là "HEK293-82", "HEK293-133", "HEK293-227"và "HEK293-515". Chọn chất huỳnh quang báo cáo là "FAM" và chất huỳnh quang dập tắt là "không có". Đặt thuốc nhuộm tham chiếu để phát hiện là "ROX" (thuốc nhuộm tham chiếu có thể được thêm vào hoặc không tùy thuộc vào kiểu máy và các yếu tố khác).

3) Trong bảng "Gán mục tiêu cho các giếng đã chọn", hãy đặt trường "Nhiệm vụ" cho các giếng đường cong chuẩn là "Chuẩn" và gán các giá trị tương ứng trong trường "Số lượng" là "300000", "30000", "3000", "300", "30" (biểu thị nồng độ DNA trên mỗi giếng, tính bằng fg/μL). Đặt tên cho các giếng trong trường "Sample Name" là "300 pg/μL", "30 pg/μL", "3 pg/μL", "300 fg/μL", "30 fg/μL". Đối với các giếng NTC, hãy đặt "Task" thành "NTC". Đối với các giếng NCS và TS, hãy đặt "Task" thành "Unknown" và đặt tên cho các giếng là "NCS" và "TS" trong trường "Sample Name". Sau khi đặt các thông số này, hãy nhấp vào "Start Run" để bắt đầu chạy thiết bị.

4) Cài đặt chương trình khuếch đại: Cài đặt chương trình khuếch đại ba bước, với thể tích phản ứng là 30 μL.

Bàn7. Quy trình PCR

7. Phân tích kết quả qPCR

1) Trong bảng "Phân tích" bên dưới "Biểu đồ khuếch đại", hệ thống sẽ tự động đặt "Ngưỡng". Đôi khi, "Ngưỡng" mặc định quá gần với đường cơ sở, gây ra sự thay đổi Ct đáng kể giữa các lần lặp lại. Bạn có thể điều chỉnh thủ công "Ngưỡng" đến vị trí thích hợp và nhấp vào "Phân tích". Tại thời điểm này, bạn có thể kiểm tra sơ bộ các đường cong khuếch đại trong "Biểu đồ đa thành phần" để xem chúng có bình thường không.

2) Trong bảng "Phân tích" trong "Đường cong chuẩn", bạn có thể đọc R², hiệu suất khuếch đại (Eff%), độ dốc và đoạn chắn của đường cong chuẩn. Đối với đường cong chuẩn chuẩn: R² > 0,99, hiệu suất khuếch đại (90% ≤ Eff% ≤ 110%) và độ dốc giữa -3,6 và -3,1.

3) Trong bảng "Phân tích" bên dưới "Bảng xem giếng", bạn có thể đọc cột "Số lượng" cho mẫu đối chứng không có mẫu (NTC), mẫu đối chứng âm tính (NCS) và mẫu thử (TS), với đơn vị là fg/μL. Các đơn vị có thể được chuyển đổi sau trong báo cáo.

4) Cài đặt tham số để phân tích kết quả phải phụ thuộc vào kiểu máy cụ thể và phiên bản phần mềm. Thông thường, máy có thể tự động diễn giải kết quả.

5) Giá trị Ct của đối chứng âm tính (NCS) phải lớn hơn giá trị Ct trung bình của nồng độ thấp nhất của đường chuẩn.

6) Kết quả của kiểm soát không có mẫu (NTC) phải là "Không xác định" hoặc có giá trị Ct ≥ 32.

Tài liệu

Thủ công