分枝杆菌QPCR检测和方法验证有助于细胞和基因治疗技术开发的发展


近年来，随着生物医药的快速发展，新冠疫情下细胞和基因治疗的兴起，以及mRNA疫苗的问世，确保生物制品的安全性和可靠性已成为各国政府和监管机构关注的焦点。支原体污染是一种常见但通常难以消除的污染类型。监管要求在涉及细胞培养的生物过程中“确保无支原体污染”。

监管机构对支原体检测的要求：

  • FDA的《行业指南：用于生产传染病适应症的病毒疫苗的细胞基质和其他生物材料的表征和鉴定》规定了对原材料、病毒种子和未加工的收获液进行支原体控制。
  • 2020年版中国药典第三部《生物制品生产检测用动物细胞基质的制备与质量控制》要求对生产细胞，包括主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）、生产终止细胞（EOPC）进行支原体检测。
  • 《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》建议在关键时间点对合适的中间样品进行支原体安全性相关检测或采取相关措施进行控制，最终产品的放行检测也需进行支原体检测。

核酸检测（NAT）和传统方法：

在核酸扩增技术（NAT）等快速检测方法出现之前，人们采用传统的培养法和指示细胞法，但由于检测周期长或灵敏度问题，这些方法往往延长生产或放行周期，或需要根据风险评估或替代方法探索有条件放行细胞材料。随着细胞和基因治疗的发展，行业对时效性和灵敏度更高的支原体检测方法的需求日益增加。产品保质期短，无法承受长时间的检测，因此NAT方法成为有利的替代方案。

目前，欧洲药典（EP）<2.6.7>、日本药典（JP）和美国药典（USP）<63>均已将NAT法收录为支原体检测方法，但该方法的验证和与传统方法的比较，确保其灵敏度不低，是其使用的前提条件。虽然2020版中国药典（ChP）尚未将NAT收录为支原体检测方法，但提到可以使用“国家药品监管部门认可的其他方法”。2022年5月，国家药品监督管理局药品审评中心发布了《免疫细胞治疗产品药品研究与评价技术指导原则（试行）》，建议在样品量有限或需要快速放行、药典方法不充分的特殊情况下，可考虑开发新的无菌和支原体检测方法进行放行检测。因此，预计NAT方法将被更多的原材料供应商和先进治疗药物（ATMP）公司采用，作为一种能够支持快速支原体释放检测的方法。

NAT 方法 - 方法验证要求

欧洲药典 <2.6> 详细描述了 NAT 方法的验证过程。7>和日本药典，内容基本一致。中国食品药品检定研究院也发表了一篇题为《支原体核酸检测方法及方法学验证的思考》的文章，旨在为我国支原体核酸扩增方法的开发者和使用者提供指导。特异性、检测限和稳健性是验证支原体核酸检测方法的关键。如果使用商品化试剂盒进行支原体检测，可以根据供应商的综合试剂盒性能报告，结合实验室环境和样本类型进行方法适用性验证。

验证报告

特异性：

特异性是指分析方法在存在其他成分（如杂质、降解产物、赋形剂等）的情况下准确测定分析物的能力。EP强调需要关注与系统发育树密切相关的其他细菌物种之间的交叉反应，例如革兰氏阳性菌中的梭菌、乳酸杆菌和链球菌。还应注意宿主细胞和实验环境中的常见污染物类型，如人类DNA污染。

检测限：

检测限是样品中可以检测到的最低分析物量，作为定性鉴定依据，无需量化为准确值。EP要求每种支原体在每个稀释浓度下有24个检测数据点。这可以通过在不同的日子进行三次独立的10倍连续稀释，每个稀释梯度重复检测八次来实现，也可以在不同的日子进行四次独立的10倍连续稀释，每个稀释梯度重复检测六次来实现。检测阳性率超过95%即可视为检测限。对于需要确认检测限的支原体类型，试剂盒制造商需要根据监管药典的要求覆盖尽可能多的支原体类型，并探索每种支原体类型的检测限。对于生物制药公司，建议也考虑人类支原体类型。

  • 如果在生产过程中使用或遇到禽类细胞或材料，则应进行滑液支原体的检测限验证。
  • 如果生产过程中使用或遇到昆虫或植物材料，则应进行无胆甾原体的检测限验证。
  • 猪鼻支原体在支原体污染样本中患病率较高，已引起中国食品药品检验研究院的关注。

与欧洲药典相比，日本药典没有提到需要进行检测限验证的禽支原体，但包括唾液支原体。

鲁棒性：

稳健性是指方法能够承受测定条件的微小变化而不受影响的能力，为已建立的方法在日常检测中的应用提供依据。稳健性的评估应重点关注支原体检测方法对检测试剂中MgCl2、引物和dNTPs浓度变化、核酸提取试剂盒或提取步骤变化、使用不同核酸扩增子等变化的耐受性。

可比性研究

如果要以NAT替代药典方法，则需要通过比较确认NAT可以替代基于培养的方法或指示细胞培养方法。这通常涉及考虑方法的检测限，以及特异性（例如支原体覆盖范围和可能的假阳性）。对于比较检测限，应满足“10 CFU/mL 的检测限可以替代基于培养的方法，100 CFU/mL 的检测限可以替代指示细胞培养方法”的标准。

进行可比性研究有两种可选方法：

  1. 使用相同的经过验证的支原体菌株对 NAT 和药典方法进行同步实验，以确认检测限。
  2. 将 NAT 验证的结果与以前的药典方法验证结果进行比较，但需要仔细记录两种方法中使用的支原体标准的确认文件。

NAT 支原体 qPCR 检测 - 综合解决方案

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Yeasen MycAway™ 支原体qPCR检测试剂盒（探针法）是基于NAT（核酸扩增技术）的快速定性检测产品，用于原材料、细胞库、病毒种子、病毒或细胞收获液、治疗细胞中潜在的支原体污染。本试剂盒基于定量PCR技术，采用Taqman荧光探针定性检测检测样本中的支原体DNA，覆盖160多种支原体DNA序列。严格遵循EP 2.6.7和JP G3对支原体检测的指导和要求，灵敏度高、特异性好、安全性高。可与MolPure®磁珠残留DNA样本预处理试剂盒配合使用，手动提取样本或使用Auto-Pure 32A全自动核酸提取仪自动提取核酸。样品经过预处理去除干扰杂质，获得纯化的支原体DNA后，通过qPCR采集探针的荧光信号，判断检测结果。

技术服务

  1. 为MycAway™支原体qPCR检测试剂盒提供全面的验证报告。
  2. 为客户样品适用性验证提供技术服务。
  3. 提供审计支持。

描述

零件编号

MolPure® 磁性残留 DNA 样本制备试剂盒

18461ES
MycAway™ 支原体 qPCR 检测试剂盒 （2G） 40619ES

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