大肠杆菌宿主细胞DNA残基检测试剂盒（2G）验证报告

大肠杆菌 宿主细胞DNA残留检测试剂盒 （2G）

资格概要（类别编号：41308ES60）

1. 背景

本报告中总结的数据由 Yeasen 生物技术针对“大肠杆菌宿主细胞DNA残留检测试剂盒（2G）”产品。摘要数据仅供用户参考，用户需自行验证宿主细胞残留 DNA方法通过使用自己的样本来确认该方法是否符合用户的要求。建议所有使用该试剂盒的实验室验证以下参数：线性、范围、准确度、精密度、定量限、特异性和稳健性。

Yeasen 生物技术公司可以提供该试剂盒的详细鉴定报告。如果用户使用此报告，则仅需评估其适用性（包括精密度、 准确性 应验证其有效性和特异性。

2. 实验材料和方法

2.1 大肠杆菌宿主细胞 DNA 残留检测试剂盒 (2G)，供应商： Yeasen，货号：41308ES60。

2.2 MolPure® 磁性残留 DNA 样本制备试剂盒，供应商： Yeasen，货号：18461ES60。

2.3 大肠杆菌DNA含量国家标准：Cat.270027，批号：201101，浓度：96.2μg/mL，保存条件：-70℃，购自：中国食品药品检定研究院。

2.4 原始资料：电子版记录于《实验报告》 父文件“大肠杆菌宿主细胞DNA残留检测试剂盒（2G）”的子文件。

2.5 方法：实验所用材料及操作方法基本由 Yeasen 经过长期评估和验证的生物技术，试剂盒的开发和生产均遵循ISO 13485体系。

3. 资格审查内容及结果

3.1 检测范围

试剂盒的线性范围为30 fg/μL~300 pg/μL，R²=1,扩增效率为101.74%,各浓度实验CV<15%。

图 1 大肠杆菌 DNA (2G) qPCR 标准曲线

3.2 准确性

3.2.1 偏离 大肠杆菌DNA含量国家标准

试剂盒中每批大肠杆菌DNA标准物质均采用大肠杆菌DNA含量国家标准进行校准。 Yeasen DNA标准物质与大肠杆菌DNA含量国家标准基本无偏差 校准曲线，测定值偏差<5％。

3.2。2 R生态恢复

3.2.2.1 空白样品加标回收率实验

分别制备高、低浓度E.coli DNA标准样品：300 pg/μL、3 pg/μL、30 fg/μL，采用磁珠法残留DNA样品前处理试剂盒提取后进行测定（每个样品重复2次提取，每次提取重复3次测定），并分析样品回收率及CV。

对于不同浓度的DNA样品，回收率为70%~130%，CV均<20%。

样品类型	理论浓度	提取 1 个均值	提取 2 个均值	平均浓度	简历	恢复
空白样品	/	/	/	/	/	/
恢复示例 1	300 皮克/微升	250.56 皮克/微升	262.11 皮克/微升	256.33 皮克/微升	4.41％	85.44％
恢复示例 2	3皮克/微升	2.29 皮克/微升	2.56 皮克/微升	2.42 皮克/微升	7.09％	80.77％
恢复示例 3	30 微克/微升	33.62 克/微升	32.61 克/微升	33.12 克/微升	14.28％	110.39％

表1 空白样品加标回收率

3.2.2.2 模拟样品加标回收实验

用5种不同的背景溶液（高蛋白、高核酸、高和低pH、高盐）提取相同浓度（3 pg/μL E.coli DNA）的样品（每个样品进行2次重复提取，每次提取进行3次重复测定），并分析样品回收率和CV。

不同背景溶液的 DNA 样本回收率范围为 70% 至 130%，所有 CV 均 <20%。

样品类型	理论浓度	提取 1 个均值	提取 2 个均值	平均浓度	简历	恢复
基本示例	/	/	/	/	/	/
高蛋白	3皮克/微升	2.25	2.23	2.24	1.09％	74.74％
高核酸		3.93	3.96	3.95	1.56％	131.52％
高盐		2.69	2.67	2.68	2.63	89.20％
高 pH 值		2.90	3.67	3.二十九	13.82％	109.55％
低 pH 值		2.77	2.87	2.82	3.41％	94.01％

表 2 基本样品加标回收率

3.3 精度

3.3.1 重复性

对浓度为 3 pg/μL 的 E.coli DNA 标准重复测定 10 次，CV <15%。

重复	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	意思是	简历
检测值 (fg/μL)	3.16	2.87	2.97	2.86	2.81	2.97	3.14	3.21	3.14	3.1	3.02	4.78％

表3 重复性结果

3.3。2 中间精度

三位实验人员独立检测了高、低浓度300 pg/μL、3 pg/μL、30 fg/μL的E.coli DNA标准样品，每个浓度做了三次重复实验，所得9个数据的CV均<15％。

经验值	实际浓度 理论浓度	大肠杆菌 DNA (2G)
		300 皮克/微升	3皮克/微升	30 微克/微升
实验 1	决定 1	295.65	3.22	26.90
	决定 2	287.71	3.24	32.00
	决定 3	300.23	3.17	27.50
实验 2	决定 4	306.06	3.13	37.30
	决定 5	299.76	3.02	32.70
	决定 6	299.63	3.02	34.00
实验 3	决定 7	266.70	3.01	35.90
	决定 8	272.89	3.09	40.70
	决定 9	276.51	3.01	35.20
/	意思是	289.46	3.10	33.60
/	简历	4.89％	3.02%	13.18％

表4 中间精密度结果

3.4 特异性

对生物制品生产中常用的细胞基因组DNA对大肠杆菌DNA检测试剂的干扰进行了评价，干扰组与对照组重叠，未见到干扰（下图依次为HEK293、Vero、CHO基因组DNA对大肠杆菌DNA检测试剂的干扰数据）。

图2 干扰实验结果

3.5 定量限

对大肠杆菌DNA进行50 fg/μL、40 fg/μL、30 fg/μL、10 fg/μL、5 fg/μL的检测，每个浓度重复10次，结果显示30 fg/μL及以上浓度的CV<20%，即大肠杆菌宿主细胞DNA残留检测试剂盒（2G）的定量限为30 fg/μL。

重复 测试项目	大肠杆菌 DNA (2G) (fg/μL)
	数量	重新计算比率
1	29.43	98.09％
2	29.51	98.35％
3	32.04	106.79％
4	26.07	86.89％
5	34.06	113.53%
6	33.54	111.79％
7	26.95	89.82％
8	27.38	91.26％
9	27.04	90.13%
10	26.10	87.02％
意思是	29.21	/
简历	10.40％	/

图3 30fg/μL E.coli DNA（2G）qPCR检测结果

3.6 稳健性

本套件已经过测试，适用于（但不限于）以下仪器：

小贩	仪器型号	扩增效率	R2	定量限（fg/μL）	简历
热	澳大利亚商业信息局 7500	101.74％	1	三十	13.30％
热	ABI QuantStudio5	100.46%	1	三十	12.40％
伯乐	CFX96	99.20％	0.999	三十	13.76％
上海红石	斯兰	100.40%	0.999	三十	11.67％

表5 仪器适用性试验结果

3.7 稳定性

3.7.1 冻融稳定性

大肠杆菌宿主细胞DNA残留检测试剂盒（2G）经10次反复冻融测试，试剂盒性能未受影响。

测试指标 冻融时间	范围	T0时间	冻融10次
标准曲线参数	扩增效率	98.23%	100.20%
	R2	1	0.999
定量限（30 fg/μL）	简历	15.07％	9.66%

表6 冻融稳定性结果分析

3.7。2 加速稳定性

E.coli 宿主细胞 DNA 残留检测试剂盒（2G）分别在 2~8°C 下保存 30 天和在 37°C 下保存 14 天。试剂盒的性能均未受到影响。

测试指标 加速温度和时间	范围	实验 1		实验 2
		T0时间	2~8℃ 30 天	T0时间	37℃ 14天
标准曲线参数	扩增效率	97.77％	99.81％	98.39％	98.65％
	R2	1	1	1	1
定量限 (30 fg/μL)	简历	11.04％	13.79％	9.55％	14.55％

表7 加速稳定性结果分析

4. 4。参考

4.1 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（三部）[S]. 北京：中国医药科技出版社，p.542-543, 2020.

4.2国家药品监督管理局，2007年：《生物制品质量控制分析方法验证技术审查通则》。

4.3 ICH(2022)《分析方法验证Q2》，征求意见稿。

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