T7高产量RNA合成试剂盒促进了不同长度不同的转录本的有效合成

这 d描述 T7 高产量 RNA 合成试剂盒

T7高产RNA合成试剂盒优化了转录反应体系，利用T7 RNA聚合酶、 升以T7启动子序列为模板，以NTP为底物，将双链DNA线性化，转录成启动子下游的DNA序列。在转录过程中，修饰的核苷酸可以 还 作为底物添加以产生生物素或染料标记的RNA。

该试剂盒可以合成 两个都 长转录本和短转录本，每1 μg DNA模板输入即可产生100-200 μg RNA。转录合成的RNA可用于各种下游应用，例如RNA结构和功能研究时长es、RNase保护、探针杂交、RNAi、显微注射和体外翻译。

合成原理

图1：体外RNA转录过程

产品优势

高产： 通过转录反应，2小时内可生产高达200 μg

更好的多功能性： 适用于20nt-10000nt RNA的转录

优异的性能： 有效减少IVT过程中转录的副产物

多种应用： 可用于普通、标记和修饰的RNA合成

产品特性

图 2：不同长度的转录本产量

图 3：不同长度的转录本的质量

图4： 表达 誊寫 信使核糖核酸 在 HEK-293 细胞

注：mRNA已用痘苗加帽酶加帽（Yeasen#10614/10615）。

实验方法

解冻试剂

    将 T7 RNA 聚合酶混合物短暂离心，然后放置 它 冰上解冻10×转录缓冲液和核苷酸s （ATP、CTP、GTP、UTP），混匀离心至管底，将10×Transcription Buffer放置室温，将4种核苷酸放置冰上。

    B.室温下组装转录反应

      按照下列体系制备反应体系：

      成分

      容量 (µL)

      最终浓度

      无 RNase H2哦

      最多 20

      -

      10×转录缓冲液

      2

      1×

      CTP / GTP / ATP / UTP (各 100 mM)

      各 2 个

      每个 10 毫米

      模板DNA

      1 微克

      -

      T7 RNA 聚合酶混合物

      2

      -

      笔记：

      1. 反应在室温下配置，由于10×Transcription Buffer中含有亚精胺，低温下亚精胺浓度过高可能会造成DNA模板沉淀。
        对于短转录本（<100 nt），可以使用2 µg 模板，转录时间延长至 4-8 小时。
        3. 对于长转录本（>1000 nt），建议使用线性化质粒作为转录模板。
        4. 在PCR仪上进行反应时，请打开热盖，以防止蒸发。
        5. 反应产物可能有白色沉淀。该沉淀是由 反应液中游离的焦磷酸根和镁离子不影响后续实验，若要除去可加入适量EDTA，若加入EDTA影响后续实验，也可离心回收上清液。
        6.保持试剂和容器不受RNase污染。
      C.37°C孵育2小时

      混匀各组分溶液，短暂离心至管底，37°C 反应 2h，若转录本长度不足 100nt，则延长反应时间至 4-8h。

      D.DNase I 处理（可选）

      反应完成后，每管加入2 μL DNase I（无RNase），37°C 孵育15分钟，以去除模板DNA。

      常见问题

      1. 转录产量低

      模板质量与产量密切相关，实验组产量明显低于对照组，可能原因有：

      • 实验模板中含有抑制成分；
      • 模板可能有问题。

      建议：①重新纯化模板；②确定模板定量及其完整性；③延长反应时间；④增加模板投入量；⑤使用其他启动子及 其他 RNA 聚合酶。

      1. 短转录本产量低

      模板片段太短会抑制反应，当转录产物小于100nt时，若想提高产量，可延长反应时间为4-8h或增加模板用量至2μg。

      1. RNA转录长度为 更大 比预期的

      若电泳结果显示产物条带大于预期大小，可能的原因有：①质粒模板没有完全线性化；②正义链的3’端有突出的结构；③RNA有未完全变性的二级结构。

      建议：①检查模板是否完全线性化，必要时进行额外的线性化；②选择合适的限制性内切酶，避免3'悬垂，或使用Klenow Fragment /T4 DNA聚合酶完成转录后再进行操作；③使用变性凝胶检测RNA产物。

      1. RNA转录长度为 更小 比预期的

      如果电泳结果显示产物条带小于预期大小，可能的原因 结论: 1、模板中含有与T7 RNA聚合酶终止子相似的终止序列; 2、模板中GC含量 模板太高。

      建议： ①降低反应温度（例如30℃）。有时降低温度有助于延长转录长度，但可能 降低产量。尝试其他 RNA聚合酶进行转录；②若模板GC含量高，可在42℃下反应，或加入SSB以增加产量和转录长度。

      1. 转录产物电泳拖尾

      电泳过程中出现拖尾现象可能的原因有： ① 实验操作过程中RNase污染； ②DNA模板被RNases污染。

      建议： ①使用无RNase的枪头和EP管，佩戴一次性乳胶手套和口罩，所有试剂均用无RNase的H2O.②重新纯化模板DNA。

      订购信息

      产品名称

      目录编号

      年代规格

      T7 高产量 RNA 合成试剂盒

      10623ES

      50/100/500 吨

      T7 RNA 聚合酶 GMP 级（250 U/μL）

      10625ES

      10千单位/100千单位/2500千单位/25万单位

      焦磷酸酶，无机 GMP 级 (1 U/μL)

      10620ES

      10U/100U/1000U

      小鼠 RNase 抑制剂 GMP 级 (40 U/μL)

      10621ES

      10千单位/20千单位/100千单位/100万单位

      mRNA痘苗加帽酶GMP级

      10614ES

      2KU/10KU/100KU

      mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶 GMP 级

      10612ES

      10千单位/50千单位/250千单位

      脱氧核糖核酸酶 I (DNase I) GMP 级

      10611ES

      500/2000/10000 美国

      Hieff NGS® mRNA 分离主试剂盒

      12603ES

      24/96 吨

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