避免使用Western印迹工作流中的常见错误

一、Western Blot 的原理

Western Blot（WB）即蛋白质免疫印迹法，是一种基于抗原抗体相互作用检测特定蛋白质的经典技术，广泛应用于分子生物学、免疫学和相关领域。其核心步骤包括：

蛋白质分离：

- SDS-PAGE 根据分子量分离变性蛋白质。

- SDS 为蛋白质覆盖一层均匀的负电荷，消除了结构影响。

膜转移：

- 蛋白质从凝胶转移到膜（例如 PVDF 或硝酸纤维素）。

抗体检测：

- 一抗特异性地结合目标蛋白，随后与酶偶联的二抗（例如 HRP）结合，产生可检测的信号，例如化学发光。

II. 标准 Western Blot 工作流程

步	关键程序	推荐试剂（Yeasen 产品）
1. 样品制备	用 RIPA 裂解缓冲液提取蛋白质；添加 PMSF 抑制蛋白酶活动。	RIPA 裂解缓冲液系列，PMSF
2. 蛋白质定量	使用 BCA 方法 (货号：20200ES) 进行定量；将标准稀释缓冲液与样品缓冲液相匹配。	BCA 定量试剂盒 (货号：20200ES/20201ES）
3. SDS-PAGE 电泳	使用预制凝胶，以 150 V 运行直至染料到达凝胶底部。	预制凝胶，SDS-PAGE 上样缓冲液
4. 膜转移和阻断	激活 PVDF 膜（编号：36125ES）在甲醇中浸泡 1 分钟；在冰浴中以 300 mA 转移 60 分钟；在室温 (RT) 下封闭 1 小时或使用快速封闭溶液 (编号：36122ES）10分钟。	特里转接缓冲液、PVDF膜系列
5. 抗体孵育	与一抗在 4°C 下孵育过夜；与二抗在室温下孵育 1-2 小时；用 TBST 彻底清洗 3 次。	抗体稀释剂
6.蛋白质检测	使用 ECL 进行开发（编号：36208ES）。	ECL化学发光系列

图 1：蛋白质印迹工作流程

三、常见问题及解决方法

问题	可能的原因	解决方案
高背景	阻塞不完全	使用新鲜的封闭液并延长封闭时间。
	清洗不充分	增加洗涤频率和持续时间以消除非特异性结合。
	一抗浓度过高	将抗体稀释至适当浓度。
	样本质量问题	检查样品的纯度和质量；使用新鲜样品。
	膜干燥	确保膜在孵育步骤中保持水合；确保与反应溶液充分接触。
信号弱或无信号	转移不完整	验证传输效率并根据需要调整时间。
	未活化 PVDF 膜	将 PVDF 浸泡在甲醇中以进行激活，然后转移到缓冲液中。
	一抗与目标物种不匹配	检查数据表，比较免疫原和蛋白质序列，并包括广泛使用的阳性对照（例如哺乳动物细胞中的β-肌动蛋白）。
	一抗与二抗不相容	确保二抗与一抗的宿主物种相匹配。
	抗体结合不足	增加抗体浓度并延长 4°C 孵育时间（例如过夜）。
	抗原水平低	每条泳道至少加载 20-30 μg 蛋白质；使用蛋白酶抑制剂和阳性对照。
	靶蛋白表达低	通过文献/数据库确认样本中的表达；浓缩样本或使用高表达对照。
非特定波段/多波段	过度传代细胞系改变蛋白质谱	使用低传代细胞（<15 代）并与早期传代细胞进行平行对照。
	蛋白质降解	在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂；储存于-80°C，避免冻融，使用新鲜样品。
	翻译后修饰	查阅文献，了解影响带大小的修改（例如，泛素化、糖基化）。
	多种剪接变体	通过文献或数据库验证剪接变体。
	蛋白质二聚体/多聚体	将新鲜的 β-巯基乙醇或 DTT 添加到 SDS 上样缓冲液中。
	外源蛋白质污染	检查外源蛋白质；如果需要则切换细胞系。
	样品加载过多	根据目标表达通过梯度测试优化负载（20-30 μg）。
	多聚体的形成	将样品煮沸 10 分钟以解离多聚体
	高一抗浓度	降低浓度和/或孵育时间以避免出现多余的条带。
	高二抗浓度	降低浓度并包括仅有的二级控制以减少非特异性结合。
	检测未报告的蛋白质或家族成员	查阅文献或 BLAST；使用推荐的细胞系/组织。
	检测未报告的蛋白质或家族成员	如果得到验证，你可能发现了一种新的蛋白质！
微笑乐队	快速迁移、高缓冲温度、过载、低缓冲	减缓迁移，预冷缓冲液，减少蛋白质负荷，确保缓冲液完全覆盖孔。
皱眉带	设备问题（例如凝胶下有气泡）	调整设置以消除气泡并确保凝胶聚合均匀。
尾带	样品溶解性差、降解、缓冲液重复使用	充分混合样品，使用新鲜样品，制备新鲜的运行缓冲液。
哑铃形弹力带	凝胶不均匀聚合，不纯样品	重铸凝胶以确保均匀性；使用前将样品离心。
带状涂抹	负荷过大，凝胶质量差	减少样品量，改进凝胶制备。
气泡痕	转移过程中夹带空气	组装转移三明治时，去除气泡。
不均匀的黑点	封闭液未溶解，抗体分布不均匀	充分溶解封闭溶液，用 TBST 洗涤 3 次，孵育期间搅拌。
白色斑块	高抗体浓度消耗底物	降低一抗/二抗浓度。

四、产品选型及优化工具

Yeasen 提供全套试剂以简化您的工作流程

相关产品：

过程	货号	产品名称	规格
样品制备	20101ES	RIPA 裂解缓冲液（强）	100 毫升
	20115ES	RIPA 裂解缓冲液（中）	100 毫升
	20114ES	RIPA 裂解缓冲液（弱）	100 毫升
	20118ES	用于 WB/IP 检测的裂解缓冲液	100 毫升
	20201ES	BCA蛋白定量试剂盒（增强型）	500吨/2500吨/5000吨
	20200ES	BCA蛋白定量试剂盒（即用型）	500吨
SDS-PAGE电泳	20350ES	Gold Band Plus 三色常规范围蛋白质标记物（8-180 kDa）	250 μL/2×250 μL/10×250 μL
	20352ES	GoldBand™ 3 色高范围蛋白质标记 (10-245 KDa)	2×250 μL/10×250 μL
	20328ES	SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒	1 套 (30~50 块凝胶)/ 1 套 (150~250 块凝胶)
	20324ES 20327ES	PAGE 凝胶快速制备试剂盒	浓度： 8%、10%、12.5%、15%
	36259ES-36280ES	预制蛋白加凝胶	浓度： 8%、10%、12%、4-12%、4-20% 加载孔选项： 10井、12井、15井
膜转移和阻断	36125ES	0.45μm PVDF膜（1卷，30cm×3m）	1 卷
膜转移和阻断	36126ES	0.22μm PVDF膜（1卷，30cm×3m）	1 卷
抗体孵育	36206ES	WB一抗及二抗稀释液	100 毫升/500 毫升
蛋白质检测	36208ES	超级ECL检测试剂	100 毫升/500 毫升
蛋白质检测	36222ES	增强型 ECL 化学发光底物试剂盒	100 毫升/500 毫升

五、如何获取支持

对于个性化故障排除或协议优化：

访问： Yeasen Western Blot 产品页面
电子邮件： info@yeasenbio.com

成功的黄金法则： 标准化流程+高品质试剂+分步验证=可重复的WB结果！

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