您對“全能” DNase i ?有多少了解

去氧核糖核酸酶 I (DNase I) 是一種非特異性的內切酶，能夠消化單股 （單股DNA） 和雙股 DNA （雙股DNA）。它水解磷酸二酯鍵，產生具有 5'-磷酸基團和 3'-OH 基團的單脫氧核苷酸和寡脫氧核苷酸。 DNase I活性的最適pH範圍為7-8，其活性依賴於Ca2+ 並可被二價金屬離子（如 Mn）活化2+, 鎂2+, 鋅2+等在Mg存在下2+，DNase I 在任意位點隨機切割雙股 DNA。在 Mn 存在下2+，DNase I 可以在同一位點切割雙股 DNA，產生平末端或帶有 1-2 個核苷酸突出的黏性末端。

圖 1. DNase I 在 Mg 存在下切割 dsDNA 的示意圖2+ 和錳2+

常見的DNase I主要從牛胰臟中純化而來，或是一種重組酵素。與從牛胰腺中純化的 DNase I 相比，重組 DNase I 具有相對較低的內源性 RNase 水平或可配製成無 RNase 產品，使其更適合於 RNase 敏感的應用，例如從 RNA 樣本中去除 DNA。

應用

在應用方面，DNase I 因其在與維持 RNA 完整性相關的實驗中的用途而聞名，例如提取不含 DNA 的 RNA、逆轉錄前製備不含 gDNA 的 RNA 模板以及體外轉錄後降解 DNA 模板。此外，它還可用於消化 rRNA 去除中的 DNA 探針、透過切口平移進行 DNA 標記、使用足跡法分析 DNA-蛋白質相互作用、產生隨機 DNA 文庫、降低細胞裂解物或蛋白質提取物的黏度、消化細胞粘連物作為細胞培養中的添加劑，以及部分裂解基因組 DNA 作為 TUNEL 檢測細胞凋亡的陽性對照。總之，DNase I 幾乎可以用於任何需要酵素消化 DNA 的應用。以下對幾種常見的應用做簡單的介紹。

  • RNA 萃取或逆轉錄前去除 gDNA

RNA作為實驗室常見的研究樣本，其本身的品質很大程度上影響著實驗數據的品質。在RNA萃取過程中一般不可能完全避免gDNA的殘留。因此，在進行具有挑戰性的下游應用（如mRNA表達分析、轉錄組分析等）之前，通常建議使用DNase I處理RNA樣本以消化殘留的gDNA。 gDNA的消化可以在RNA萃取期間、RNA萃取之後或RNA逆轉錄之前進行。

圖 2. 基於 DNase I 的 gDNA 去除過程

  • 體外轉錄中模板 DNA 的去除

體外轉錄（IVT）主要使用DNA作為模板，在適當的底物和緩衝液的影響下產生RNA。過程中常用的RNA聚合酶包括T7、T3和SP6，負責催化RNA合成。然而合成的RNA產物可能含有DNA殘基，消除這些殘基有利於下游實驗。

特別是在mRNA疫苗的研發過程中，去除這些DNA殘留是關鍵的一步，直接影響後續純化過程的難度和最終產品的純度。為了有效消除模板DNA，通常使用DNase I進行處理，確保RNA樣本中不含DNA殘留，有助於提高實驗整體的準確性和效率。

圖3：以線性化質粒為模板的體外轉錄過程[4]

  • RNA 文庫建構和定序中的 rRNA 去除

在生物體中，rRNA含量極為豐富，且保守性較高，對於取得生物資訊研究意義不大。然而，實驗中萃取的總RNA中95%是人類rRNA，這些rRNA的存在可能會幹擾目標RNA的檢測。因此，在RNA文庫製備和定序中，通常會先去除rRNA。目前，rRNA去除的主要方法是RNAase消化，其主要操作 步驟和原則如下：

  1. 萃取總RNA；
  2. 將單股DNA探針與rRNA分子雜交（註：設計與合成rRNA特異性單股DNA探針）；
  3. RNase H降解雜交的rRNA；
  4. DNase I 降解 DNA 探針；
  5. rRNA 成功移除，留下非 rRNA RNA 模板。

圖4：基於酵素法的rRNA去除原理示意圖[5]

  • DNA 標記的缺口平移

缺口平移是實驗室中標記去氧核糖核酸探針最常用的方法。該方法是透過 DNase I 和 大腸桿菌 DNA 聚合酶 I。

主要原理如下：

  1. 首先，使用適當濃度的 DNase I 在待標記的雙股 DNA 的每條鏈上製造多個單鏈缺口，在缺口部位形成 3' 羥基末端。
  2. 然後，利用 5'→3' 核酸外切酶活性 大腸桿菌DNA 聚合酶 I 去除切口 5' 端的一個核苷酸，而 5'→3' 聚合酶活性 E. 大腸桿菌 DNA聚合酶I將標記的核苷酸引入缺口的3'端進行修復。當切口沿著 DNA 鏈移動時，標記的核苷酸被整合到新合成的 DNA 鏈中。

圖5：缺口平移法DNA標記原理示意圖[6]

  • DNase I 足跡分析實驗

DNase I 足跡分析是一種精確辨識 DNA 分子上 DNA 結合蛋白結合位點的方法。其原理是與 DNA 片段結合的蛋白質保護結合區域不被 DNase I 降解。在凝膠影像中，沒有與蛋白質結合區域相對應的帶。

主要原理如下：

  1. 標記待測試的雙股 DNA 分子的單股末端。
  2. 將蛋白與DNA混合，加入適量DNase I進行酵素切，形成不同長度的DNA片段。應控制酵素的量以確保相鄰的 DNA 片段僅相差一個核苷酸，並且應平行包括不添加蛋白質的對照。
  3. 從DNA中去除蛋白質，用PAGE電泳分離變性的DNA，放射自顯影，透過與對照組的比較，解釋足跡區域的核苷酸序列。

圖6：DNase I足跡分析原理示意圖[7]

這 脫氧核糖核酸酶 選擇指南 Yeasen

為了滿足各種應用需求， Yeasen 提供 重組 脫氧核糖核酸酶 在 大腸桿菌，並可提供GMP級的DNase I，滿足mRNA體外轉錄等應用的要求。

產品定位

應用

產品名稱

目錄編號

無 RNase

從 RNA 和蛋白質製劑中去除 DNA

重組 DNase I（無 RNase）

10325ES

GMP級， 無 RNase

mRNA體外轉錄

UCF.ME® 去氧核糖核酸酶 I (DNase I) GMP 級

10611ES

參考

[1] Ndiaye C、Mena M、Alemany L 等人。頭頸癌的 HPV DNA、E6/E7 mRNA 和 p16INK4a 檢測：系統性回顧和薈萃分析[J]。柳葉刀腫瘤學，2014,15(12):1319-1331。

[2] Broccolo F、Fusetti L、Rosini S 等人。子宮頸樣本中致癌 HPV 型特異性病毒 DNA 量與 E6/E7 mRNA 檢測的比較：多中心研究的結果[J]。醫學病毒學雜誌，2013,85(3):472-482。

[3] Huang Z, Fasco MJ, Kaminsky LS. 優化 DNA 酶 I 從 RNA 中去除污染 DNA 以用於定量​​ RNA-PCR[J]。生物技術，1996,20(6):1012-1020。

[4] 康大同, 李華, 董艷. 體外轉錄mRNA（IVT mRNA）在臨床轉殖中的應用進展[J].先進藥物傳輸評論，2023，199：114961。

[5] Wiame I、Remy S、Swennen R 等人。無 RNA 降解的 DNase I 不可逆熱失活[J]。生物技術，2000，29（2）：252-256。

[6] Adolph S, Hameister H. 利用生物素標記的 d-UTP 進行中期染色體的原位缺口平移[J]。人類遺傳學，1985，69：117-121。

[7] 宋晨, 張勝, 黃華. 選擇合適的方法識別微生物基因組中的複製起點。 前沿微生物學，2015，6：1049。

詢問