避免使用Western印跡工作流中的常見錯誤

一、Western Blot 的原理

蛋白質印跡法（Western Blot，WB）是一種基於抗原抗體交互作用檢測特定蛋白質的經典技術，廣泛應用於分子生物學、免疫學及相關領域。其核心步驟包括：

蛋白質分離：

- SDS-PAGE 依分子量分離變性蛋白質。

- SDS 為蛋白質覆蓋一層均勻的負電荷，消除了結構影響。

膜轉移：

- 蛋白質從凝膠轉移到膜（例如 PVDF 或硝酸纖維素）。

抗體檢測：

- 一抗特異性地結合目標蛋白，隨後與酶偶聯的二抗體（例如 HRP）結合，產生可檢測的信號，例如化學發光。

二.標準 Western Blot 工作流程

步	關鍵程式	推薦試劑（Yeasen 產品）
1. 樣品製備	用RIPA裂解緩衝液萃取蛋白質；加入 PMSF 來抑制蛋白酶活動。	RIPA 裂解緩衝液系列，PMSF
2. 蛋白質定量	使用 BCA 方法 (貨號：20200ES)進行量化；將標準稀釋緩衝液與樣品緩衝液配對。	BCA 定量試劑盒 (貨號：20200ES/20201ES）
3. SDS-PAGE 電泳	使用預製凝膠，以 150 V 運行直至染料到達凝膠底部。	預製凝膠，SDS-PAGE 上樣緩衝液
4. 膜轉移與阻斷	活化 PVDF 膜（編號：36125ES）甲醇中浸泡1分鐘；在冰浴中以 300 mA 轉移 60 分鐘；室溫下封閉 1 小時或使用快速封閉溶液 (編號：36122ES）10分鐘。	崔轉接緩衝液、PVDF膜系列
5. 抗體孵育	與一抗在4°C孵育過夜；二抗室溫孵育1-2小時；用 TBST 徹底清洗 3 次。	抗體稀釋劑
6.蛋白質檢測	使用 ECL 進行開發（編號：36208ES）。	ECL化學發光系列

圖 1：蛋白質印跡工作流程

三常見問題及解決方案

問題	可能的原因	解決方案
高背景	阻塞不完全	使用新鮮的封閉液並延長封閉時間。
	清洗不充分	增加洗滌頻率和持續時間以去除非特異性結合。
	一抗濃度過高	將抗體稀釋至適當濃度。
	樣本品質問題	檢查樣品的純度和品質；使用新鮮樣品。
	膜乾燥	確保膜在孵育步驟期間保持水合；確保與反應溶液充分接觸。
訊號弱或無訊號	轉移不完整	驗證傳輸效率並根據需要調整時間。
	未活化 PVDF 膜	將 PVDF 浸泡在甲醇中以進行激活，然後轉移到緩衝液中。
	一抗與目標物種不匹配	檢查資料表，比較免疫原和蛋白質序列，並包含廣泛使用的陽性對照（例如哺乳動物細胞中的β-肌動蛋白）。
	一抗與二抗不相容	確保二抗與一抗的宿主物種相符。
	抗體結合不足	增加抗體濃度並延長 4°C 孵育時間（例如過夜）。
	抗原水準低	每泳道至少上樣20-30 μg蛋白質；使用蛋白酶抑制劑和陽性對照。
	標靶蛋白表達低	透過文獻/資料庫確認樣本中的表達；濃縮樣本或使用高表達控制。
非特定波段/多波段	過度傳代細胞系改變蛋白質譜	使用低傳代細胞（<15 代）並與早期傳代細胞進行平行對照。
	蛋白質降解	在裂解緩衝液中加入蛋白酶抑制劑；保存於-80°C，避免凍融，使用新鮮樣本。
	翻譯後修飾	查閱文獻，了解影響帶大小的修改（例如，泛素化、糖基化）。
	多種剪接變異體	透過文獻或資料庫驗證剪接變異體。
	蛋白質二聚體/多聚體	將新鮮的 β-巰基乙醇或 DTT 加入 SDS 上樣緩衝液中。
	外源蛋白質污染	檢查外源蛋白質；如果需要的話，切換細胞系。
	樣品加載過多	根據目標表達通過梯度測試優化負載（20-30 μg）。
	多聚體的形成	將樣品煮沸 10 分鐘以分離多聚體
	高一抗濃度	降低濃度和/或孵育時間以避免多餘的條帶。
	高二抗濃度	降低濃度並包括僅有的二級控制以減少非特異性結合。
	檢測未報告的蛋白質或家族成員	查閱文獻或BLAST；使用建議的細胞系/組織。
	檢測未報告的蛋白質或家族成員	如果得到驗證，你可能發現了一種新的蛋白質！
微笑樂隊	快速遷移、高緩衝溫度、過載、低緩衝	減緩遷移，預冷緩衝液，減少蛋白質負荷，確保緩衝液完全覆蓋孔洞。
皺眉帶	設備問題（例如凝膠下有氣泡）	調整設定以消除氣泡並確保凝膠聚合均勻。
尾帶	樣品溶解性差、降解、緩衝液重複使用	充分混合樣品，使用新鮮樣品，製備新鮮的運行緩衝液。
啞鈴形彈性帶	凝膠不均勻聚合，不純樣品	重新鑄造凝膠以確保均勻性；使用前將樣品離心。
帶狀塗抹	負荷過大，凝膠品質差	減少樣品量，改進凝膠製備。
氣泡痕	轉移過程中夾帶空氣	組裝轉移三明治時，去除氣泡。
不均勻的黑點	封閉液未溶解，抗體分佈不均勻	充分溶解封閉溶液，用 TBST 洗滌 3 次，培養期間攪拌。
白色斑塊	高抗體濃度消耗底物	降低一抗/二抗濃度。

四、產品選擇及優化工具

Yeasen 提供全套試劑以簡化您的工作流程

相關產品：

流程	貓。不。	產品名稱	規格
樣品製備	20101ES	RIPA 裂解緩衝液（強）	100 毫升
	20115ES	RIPA 裂解緩衝液（中）	100 毫升
	20114ES	RIPA 裂解緩衝液（弱）	100 毫升
	20118ES	用於 WB/IP 檢測的裂解緩衝液	100 毫升
	20201ES	BCA蛋白定量試劑盒（增強型）	500噸/2500噸/5000噸
	20200ES	BCA蛋白定量試劑盒（即用型）	500噸
SDS-PAGE電泳	20350ES	Gold Band Plus 三色常規範圍蛋白質標記物（8-180 kDa）	250 μL/2×250 μL/10×250 μL
	20352ES	GoldBand™ 3 色高範圍蛋白質標記 (10-245 KDa)	2×250 μL/10×250 μL
	20328ES	SDS-PAGE 凝膠製備試劑盒	1 套 (30~50 塊凝膠)/ 1 套 (150~250 塊凝膠)
	20324ES 20327ES	PAGE 凝膠快速製備試劑盒	濃度： 8%、10%、12.5%、15%
	36259ES-36280ES	預製蛋白加凝膠	濃度： 8%、10%、12%、4-12%、4-20% 載入孔選項： 10井、12井、15井
膜轉移和阻斷	36125ES	0.45μm PVDF膜（1卷，30cm×3m）	1 卷
膜轉移和阻斷	36126ES	0.22μm PVDF膜（1卷，30cm×3m）	1 卷
抗體孵育	36206ES	WB一抗及二抗稀釋液	100 毫升/500 毫升
蛋白質檢測	36208ES	超級ECL檢測試劑	100 毫升/500 毫升
蛋白質檢測	36222ES	增強型 ECL 化學發光底物試劑盒	100 毫升/500 毫升

五、如何獲取支持

對於個人化故障排除或協定優化：

訪問： Yeasen Western Blot 產品頁面
電子郵件： info@yeasenbio.com

成功的黃金法則： 標準化流程+高品質試劑+逐步驗證=可重複的WB結果！

下一篇文章