——المزيد من تحديد النمط الجيني، ووقت أقل وكواشف أقل
غالبًا ما تتطلب عملية تحديد النمط الجيني باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل وغيره من التجارب تنقية الحمض النووي الجينومي من العينات. وعندما يكون هناك العديد من العينات التي يتعين اختبارها، فإن عملية تنقية الحمض النووي الجينومي تستغرق وقتًا طويلاً وتتكرر وتكلف الكثير من المال. قامت شركة YEASEN Biology بتطوير سلسلة من منتجات Direct PCR Kit عن طريق تعديل بوليميراز Taq DNA وتحسين نظام تفاعل PCR، مما يلغي الحاجة إلى تنقية الجينوم.
PCR الذكي: PCR المباشر
تبدأ مجموعة YEASEN Direct PCR مباشرة من العينة، باستخدام كميات ضئيلة من العينات الخام (الشكل 1-أ) أو منتجات محاليلها (الشكل 1-ب) دون تنقية جينية كقوالب للتصنيف الجيني القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 1). وبالمقارنة بالتصنيف الجيني القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي، تستخدم مجموعة Direct PCR عينة أقل، ويسهل تشغيلها، وتكلفتها التجريبية منخفضة، وتسمح باكتشاف العينات بمعدل إنتاجية مرتفع.
الشكل 1 سير عمل تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر
أ. الطريقة المباشرة: خذ كمية صغيرة من العينة وأضفها مباشرة إلى مزيج PCR الرئيسي للتعريف بـ PCR.المزايا التقنية
مباشرة: ليست هناك حاجة لتنقية الحمض النووي التي تستغرق وقتًا طويلاً ومكلفة.
سريع: يتم إعداد القالب في 10 دقائق، ويتم إكمال تفاعل PCR في أقل من 30 دقيقة.
ببساطة: يمكن تحليل العينات دون الحاجة إلى التقطيع أو الطحن، ويكون مزيج PCR في شكل مخلوط مسبقًا، مما يقلل من عدد خطوات التقطير.
التوفير: كمية صغيرة من المواد المستخدمة.
إنتاجية عالية: يمكن إكمال تفاعلات التحلل في لوحة مكونة من 96 بئرًا.
مقاوم للتثبيط: متسامح مع عينات مختلفة من الحيوانات والنباتات.
عملية تجريبية لمجموعة تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر
تستخدم هذه السلسلة من المنتجات نظام تحلل البروتيناز الفريد لتحلل العينات. يمكن استخدام محلول التحلل مباشرة كقالب وإقرانه بمزيج PCR Master Mix المقدم في المجموعة لتضخيم الجينات.
الشكل 2 عملية تجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر على أنسجة الفئران
تين.3 عملية تجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر على الأنسجة النباتية
جدول اختيار المنتج لتقنية PCR المباشرة
| سلسلة المنتجات | الجيل الثاني من تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل المباشر للفأرة | |||
| رقم المنتج | 10189ES | 10185ES | 10188ES | 10187ES |
| تحديد | 20 طن/50 طن/200 طن/500 طن | 50 طن/200 طن | 20 طن/50 طن/200 طن/500 طن | 50 طن/200 طن |
| سمات | ||||
| طول الأمبليكون | ≤5 كيلو بايت | ≤1 كيلو بايت | ≤8 كيلو بايت | ≤1 كيلو بايت |
| وقت التمديد (ثانية/كيلو بايت) | 3-20 ثانية | 30 ثانية | ≤2 كيلو بايت: 3-5 ثانية ≤8 كيلو بايت: 10 ثانية | 60 ثانية |
| الكائنات الحية القابلة للتطبيق | الفئران والجرذان | الفئران والجرذان | البشر، الفئران، الماعز، الدجاج، الخنازير، الخ. | الأرز، الذرة، التبغ، بذور اللفت، القمح، فول الصويا، الخ. |
| أنواع الأنسجة/المواد القابلة للتطبيق | ذيل الفأر، أذن الفأر، أصابع القدم (مع العضلات)، والأعضاء الأخرى | ذيل الفأر، أذن الفأر، أصابع القدم (مع العضلات)، والأعضاء الأخرى | الدم الطازج المحتوي على مضادات التخثر الشائعة مثل EDTA، والهيبارين، والسيترات، والدم المبرد (المجمد)، وبقع الدم المجففة التجارية مثل Whatman903® واتفاقية التجارة الحرة® | أوراق رقيقة، أوراق قديمة، شتلات، سيقان رقيقة |
| استخدام العينة | الأنسجة: 5 ملغ ذيل الفأر: 1-5 مم | الأنسجة: 5-10 ملغ ذيل الفأر: 1-5 ملم | الدم الكامل: 0.5%-20% واتمان® بقع الدم المجففة: 1 مم2 | الورقة: 1-10 ملم البذور: 1-3 ملم |
| وقت إطلاق الجينوم | 5-10 دقيقة | 15 دقيقة | 0-3 دقيقة | 0-10 دقيقة |
| هيكل المنتج النهائي | نهايات حادة | نهايات حادة | نهايات حادة | نهايات حادة |
| درجة حرارة التلدين | درجة الحرارة-(2~5) درجة مئوية | درجة الحرارة-(2~5) درجة مئوية | درجة الحرارة-(1~2) درجة مئوية | درجة الحرارة-(2~5) درجة مئوية |
| نطاق قص GC | 29-70% | 30-70% | 30-75% | 40-65% |
| نشاط إكسونوكلياز 5'-3' | نعم | نعم | نعم | نعم |
| التطبيقات | ||||
| تحديد النمط الجيني | نعم | نعم | نعم | نعم |
| تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد | حتى 5x |
| حتى 3-4x |
|
| تضخيم العينة المباشرة | نعم | نعم | نعم | نعم |
| مميزات اخرى | ||||
| مؤشر الرحلان الكهربائي | عديم اللون | أزرق | عديم اللون | أزرق |
| بداية ساخنة | نعم | نعم | نعم | نعم |
| مُختلطة مسبقًا/مجموعة | مجموعة (مع مزيج) | مجموعة (مع مزيج) | مجموعة (مع مزيج + عازل) | مجموعة (مع مزيج) |
مزايا المنتج
إن بوليميراز Taq DNA المعدل هو ضمان لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر: فهو يتمتع بتحمل فائق للمثبطات.
عند استخدام عينات غير نقية كقوالب، يتم إدخال العديد من المكونات التي تمنع تفاعلات PCR. من الصعب تحقيق نتائج مثالية، أو حتى من المستحيل إجراء تضخيم PCR، باستخدام أنظمة تفاعل PCR العادية وبوليميراز Taq DNA. مزيج PCR في هذه السلسلة من الأدوات هو مزيج مسبق مُحسَّن بالصيغة، باستخدام بوليميراز Taq DNA المعدل، مما يزيد من قدرة الارتباط بقالب DNA ولديه قدرة تحمل أعلى لمثبطات PCR الشائعة، وبالتالي لديه قدرة تكيف أوسع للقالب.
الشكل 4: يتمتع مزيج PCR في مجموعة Direct PCR بتحمل أعلى للشوائب. يتم استخدام نفس كمية القالب لتفاعل البوليميراز المتسلسل مع مخاليط تفاعل البوليميراز المتسلسل المختلفة، ويتم إضافة تركيزات مختلفة من مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى النظام. تتم مقارنة كمية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في ظل ظروف مختلفة.
يخفف لقد طورت سلسلة من المنتجات لعينات مختلفة:
- I. النوع الخاص بالقوارض: مجموعة تفاعل البلمرة المتسلسل المباشر للأنسجة الفأرية (10189ES)
العينات القابلة للتطبيق: أنسجة الفأر (مثل ذيل الفأر، أذن الفأر، إصبع قدم الفأر، إلخ.)
- كفاءة تضخيم عالية (الطول، السرعة، توافق GC)
الشكل 5 تعمل مجموعة Mouse Tissue Direct PCR Kit Plus على تضخيم المحاليل من أنسجة مختلفة. 1: البلازميد؛ 2: أذن الفأر؛ 3: ذيل الفأر؛ 4: الكبد. ظروف التحلل: تحلل عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتعطيل عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الأجزاء المستهدفة هي 1 كيلو بايت، 2 كيلو بايت، 3 كيلو بايت و 6 كيلو بايت، مع أوقات تمديد مضبوطة على 3 و5 و10 و20 ثانية/كيلو بايت على التوالي. م: 10510ES60 (ييسن).
- التوافق الواسع للقالب (10189ES)
الشكل 6 تم استخدام مجموعة Mouse Tissue Direct PCR Kit Plus لتحليل 293 خلية بشرية بشكل مباشر (70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق) وتضخيمها (1) اللعاب (2) وأنسجة فروة الرأس (3). أظهرت جميع العينات نطاقات هدف واضحة، M: 10510ES60 (YEASEN).
- II. فصيلة الدم العالمية متعددة الأنواع: مجموعة اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر المتقدم للدم (10188ES)
- طول التضخيم يصل إلى 8 كيلو بايت
الشكل 7 تم تضخيم شظايا DNA ذات أطوال مختلفة مباشرة من دم بشري كامل باستخدام مجموعة Blood Advanced Direct PCR. تم تخزين عينات الدم عند درجة حرارة -20 درجة مئوية مع EDTA كمضاد للتخثر. كان تركيز قالب الدم 10%، وتم ضبط وقت التمديد على 10 ثوانٍ/كيلو بايت. M: 10510ES60 (YEASEN).
- تحمل عالي
الشكل 8 أ: تُستخدم مجموعة Blood Advanced Direct PCR لتضخيم جزء DNA بحجم 2 كيلو بايت مع محتوى GC بنسبة 71% مباشرةً من دم كامل مضاد للتخثر EDTA. يتم ضبط تركيز قالب الدم على تدرج من 0.5 إلى 50%، ويتم ضبط وقت التمديد على 10 ثوانٍ/كيلو بايت. ب: تُستخدم مجموعة Blood Advanced Direct PCR لتضخيم جزء DNA بحجم 2.2 كيلو بايت مع محتوى GC بنسبة 67% مباشرةً من دم كامل مضاد للتخثر من الفأر EDTA. يتم ضبط تركيز قالب الدم من 0.5 إلى 50%، ووقت التمديد 10 ثوانٍ/كيلو بايت. M: 10510ES60 (YEASEN).
- III. النوع الخاص بالنبات: مجموعة تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر للأنسجة النباتية (10187ES)
- تم التحقق من ذلك باستخدام أنواع متعددة من عينات النباتات
الشكل 9: تنتج عملية التضخيم المباشر من أنسجة أوراق أنواع مختلفة من النباتات. م: سلم DNA بطول 100 زوج قاعدي. ج: DNA الجينومي المنقى من النباتات المقابلة كقالب. 1-2: مستخلص أنسجة الأوراق كقالب. عدد الدورات: 30 دورة.
حالة العميل
- 1. تحديد النمط الجيني للفأر
شركة بيولوجية في قوانغتشو:
الشكل 10 تضخيم ذيل الفأر باستخدام مجموعة Mouse Direct PCR (10189ES). الجين المستهدف: 500 زوج قاعدي؛ زمن التحلل: 10 دقائق؛ نظام تفاعل PCR: 25 ميكرولتر، زمن التمديد: 5 ثوانٍ/كيلو بايت.
- ثانيا.تضخيم جين الأرز بشكل مباشر
XX جامعة
الشكل 11 يتم استخدام مجموعة Plant Direct PCR (10187ES) لتضخيم الجينات المرتبطة بالأرز.
رمبتهج صالمنتجات
| تحديد موقع المنتج | اسم المنتج | رقم المنتج | مواصفات المنتج |
| أجاروز عالي الجودة | 10208ES60/76 | 100 جرام/500 جرام | |
| بقع الأحماض النووية (تحت الأشعة فوق البنفسجية) | 10202ES76 | 500 ميكرولتر | |
| ترقية سريعة لتفاعل البوليميراز المتسلسل، يمكن أن تكون تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرات ومناسبة لتضخيم القالب المعقد | 2×هايفالعلامة التجارية مزيج رئيسي من PCR HotStart Ultra-Rapid II | 10167ES03/08 | 1 مل/5×1 مل |