I de senere år, med den hurtige udvikling af biomedicin, fremkomsten af celle- og genterapier under COVID-19-pandemien og fremkomsten af mRNA-vacciner, er sikring af sikkerheden og pålideligheden af biologiske produkter blevet et omdrejningspunkt for regeringer og regulerende organer verden over. Mycoplasma-kontamination er en almindelig, men typisk udfordrende type forurening at eliminere. Lovgivningsmæssige krav pålægger at "sikre ingen mycoplasma-kontamination" for bioprocesser, der involverer cellekultur.
Regulatoriske myndigheders krav til Mycoplasma-testning:
- FDA's "Guidance for Industry: Karakterisering og kvalificering af cellesubstrater og andre biologiske materialer, der anvendes i produktionen af virale vacciner til indikationer af infektionssygdomme" fastlægger mycoplasmakontrol for råmaterialer, virale frø og uforarbejdede høstvæsker.
- 2020-udgaven af den kinesiske farmakopé, del III "Forberedelse og kvalitetskontrol af animalske cellesubstrater, der bruges til biologisk produktproduktionstestning" kræver mycoplasmatestning for produktionsceller, herunder Master Cell Banks (MCB), Working Cell Banks (WCB) og End-of-Production Cells (EOPC).
- De "Tekniske retningslinjer for farmaceutisk forskning og evaluering af immuncelleterapiprodukter (forsøg)" anbefaler at udføre mycoplasma sikkerhedsrelateret testning på egnede mellemliggende prøver på vigtige tidspunkter eller implementere relevante foranstaltninger til kontrol. Mycoplasma-test er også påkrævet som frigivelsestest for slutprodukter.
Nukleinsyretestning (NAT) og traditionelle metoder:
Før fremkomsten af hurtige detektionsmetoder, såsom Nucleic Acid Amplification Technology (NAT), blev traditionelle dyrkningsmetoder og indikatorcelleassays anvendt. Men på grund af lange detektionscyklusser eller følsomhedsproblemer forlængede disse metoder ofte produktions- eller frigivelsescyklusser eller nødvendiggjorde betinget frigivelse af cellematerialer baseret på risikovurdering eller udforskning af alternative metoder. Med fremskridt inden for celle- og genterapier er der en stigende efterspørgsel inden for industrien efter mycoplasma-detektionsmetoder med højere aktualitet og følsomhed. Produkternes korte holdbarhed kan ikke holde til lange testperioder, så NAT-metoder er dukket op som gunstige alternativer.
I øjeblikket har European Pharmacopoeia (EP) <2.6.7>, Japanese Pharmacopoeia (JP) og United States Pharmacopeia (USP) <63> alle inkluderet NAT-metoder som mycoplasma-detektionsmetoder. Imidlertid er validering af denne metode og sammenligning med traditionelle metoder for at sikre, at dens følsomhed ikke er ringere, forudsætninger for dens anvendelse. Selvom 2020-udgaven af Chinese Pharmacopoeia (ChP) ikke har inkluderet NAT som en mycoplasma-detektionsmetode, nævner den muligheden for at bruge "andre metoder, der er anerkendt af den nationale lægemiddeltilsynsmyndighed." I maj 2022 udgav Drug Review Center for National Medical Products Administration (NMPA) "Technical Guidelines for Pharmaceutical Research and Evaluation of Immune Cell Therapy Products (Trial)," som foreslår at overveje udviklingen af nye sterile og mycoplasma-detektionsmetoder til frigivelsestestning under særlige omstændigheder, når prøvevolumen er begrænset, eller der er behov for hurtig frigivelse i farmako-pecial metode. Derfor forventes NAT-metoder i stigende grad at blive brugt af flere råvareleverandører og Advanced Therapy Medicinal Product (ATMP) virksomheder som en metode, der er i stand til at understøtte hurtig mycoplasma-frigivelsestest.
NAT-metode - Metodevalideringskrav
Valideringsprocessen for NAT-metoder er udførligt beskrevet i European Pharmacopoeia <2.6.7> og japansk farmakopé, hvor deres indhold i det væsentlige er konsistent. National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC) har også udgivet en artikel med titlen "Considerations on Nucleic Acid Detection Methods and Methodological Validation for Mycoplasma Examination", med det formål at give vejledning til udviklere og brugere af mycoplasma-nukleinsyreamplifikationsmetoder i Kina. Specificitet, detektionsgrænse og robusthed er afgørende for validering af mycoplasma NAT-metoder. Hvis der anvendes kommercielle kits til mycoplasma-detektion, kan metode-egnethedsvalidering udføres baseret på leverandørens omfattende kit-ydelsesrapport kombineret med laboratoriemiljøet og prøvetypen.
Specificitet:
Specificitet refererer til en analysemetodes evne til nøjagtigt at bestemme analytten i nærværelse af andre komponenter (såsom urenheder, nedbrydningsprodukter, hjælpestoffer osv.). EP understreger behovet for at fokusere på krydsreaktioner mellem andre bakteriearter, der er tæt beslægtet med det fylogenetiske træ, såsom Clostridium, Lactobacillus og Streptococcus inden for de gram-positive bakterier. Der bør også lægges vægt på almindelige forureningstyper som human DNA-kontamination i værtsceller og eksperimentelle miljøer.
Detektionsgrænse:
Detektionsgrænsen er den laveste mængde analyt, der kan påvises i en prøve. Det tjener som et kvalitativt identifikationsgrundlag og skal ikke kvantificeres som en nøjagtig værdi. EP kræver 24 detektionsdatapunkter for hver mycoplasmaart ved hver fortyndingskoncentration. Dette kan opnås ved at udføre tre uafhængige 10 gange serielle fortyndinger på forskellige dage med otte gentagne detektioner for hver fortyndingsgradient, eller ved at udføre fire uafhængige 10 gange serielle fortyndinger på forskellige dage med seks gentagne detektioner for hver fortyndingsgradient. En detektionspositivitetsrate på over 95 % kan betragtes som detektionsgrænsen. For mycoplasmatyper, der kræver bekræftelse af detektionsgrænsen, skal kitfabrikanterne dække så mange mycoplasmatyper som muligt som krævet af lovmæssige farmakopéer og undersøge detektionsgrænserne for hver mycoplasmatype. For biofarmaceutiske virksomheder er det tilrådeligt også at overveje humane mycoplasmatyper.
- Hvis der anvendes eller stødes på fugleceller eller -materialer under produktionsprocessen, bør verifikationen af detektionsgrænsen for Mycoplasma synoviae udføres.
- Hvis der anvendes eller stødes på insekt- eller plantematerialer under produktionsprocessen, skal detektionsgrænsen for Acholeplasma udføres.
- Porcin nasal mycoplasma er meget udbredt i mycoplasma-kontaminerede prøver og har tiltrukket sig opmærksomhed fra China Institute for Food and Drug Control.
I sammenligning med den europæiske farmakopé nævner den japanske farmakopé ikke aviær mycoplasma, for hvilken der kræves verifikation af detektionsgrænsen, men omfatter spytmycoplasma.
Robusthed:
Robusthed refererer til en metodes evne til at modstå små variationer i måleforhold uden at blive påvirket, hvilket giver grundlag for den etablerede metodes anvendelse i rutinetest. Evaluering af robusthed bør fokusere på tolerancen af mycoplasma-detektionsmetoder over for variationer i koncentrationen af MgCl2, primere og dNTP'er i detektionsreagenser, ændringer i nukleinsyreekstraktionssæt eller ekstraktionstrin og brugen af forskellige nukleinsyreforstærkere.
Sammenlignelighedsundersøgelse
Hvis NAT skal bruges som erstatning for farmakopémetoder, er det nødvendigt at bekræfte gennem sammenligning, at NAT kan erstatte kulturbaserede metoder eller indikatorcelledyrkningsmetoder.Dette involverer typisk overvejelse af metodens detektionsgrænse samt specificitet (såsom rækkevidden af mycoplasmadækning og mulige falske positive). For at sammenligne detektionsgrænser bør det opfylde kriterierne om, at "en detektionsgrænse på 10 CFU/mL kan erstatte kulturbaserede metoder, og en detektionsgrænse på 100 CFU/mL kan erstatte indikatorcellekulturmetoder."
Der er to valgfri tilgange til at udføre sammenlignelighedsundersøgelser:
- Udførelse af synkrone eksperimenter med de samme validerede mycoplasma-stammer til både NAT- og farmakopémetoder for at bekræfte detektionsgrænsen.
- Sammenligning af resultaterne af NAT-validering med tidligere farmakopémetodevalideringsresultater, men omhyggelig dokumentation af bekræftelsesfilerne for de mycoplasmastandarder, der anvendes i begge metoder, er påkrævet.
NAT Mycoplasma qPCR-detektion - omfattende løsning
Relaterede produkter
Yeasen MycAway™ Mycoplasma qPCR Test Kit (probemetode) er et hurtigt kvalitativt detektionsprodukt baseret på NAT (nukleinsyreamplifikationsteknikker) til potentiel mycoplasmakontamination i råmaterialer, cellebanker, virale frø, virus- eller cellehøstvæsker og terapeutiske celler. Dette kit, der er baseret på kvantitativ PCR-teknologi, bruger Taqman-fluorescensprober til kvalitativt at detektere mycoplasma-DNA i testprøven, der dækker over 160 mycoplasma-DNA-sekvenser. Det følger nøje retningslinjerne og kravene i EP 2.6.7 og JP G3 til mycoplasma-detektion, hvilket viser høj sensitivitet, god specificitet og sikkerhed. Den kan bruges sammen med MolPure® Magnetic Bead Residual DNA Sample Pretreatment Kit til manuelt at udtrække prøver eller automatisk ekstrahere nukleinsyrer ved hjælp af Auto-Pure 32A fuldautomatisk nukleinsyreekstraktor. Efter prøveforbehandling for at fjerne forstyrrende urenheder og opnå oprenset mycoplasma-DNA, opsamles probens fluorescenssignal gennem qPCR for at bestemme påvisningsresultatet.
Tekniske tjenester
- Leverer omfattende valideringsrapporter for MycAway™ Mycoplasma qPCR-testsættet.
- Tilvejebringelse af tekniske tjenester til validering af kundeprøver.
- Ydelse af revisionsstøtte.
| Beskrivelse | Varenummer |
| 18461ES | |
| MycAway™ Mycoplasma qPCR-detektionskit (2G) | 40619ES |