Forskellige typer af magnetiske perler i NGS: DNA\RNA\mRNA magnetiske perler
Magnetiske perler er et af de nødvendige produkter i konstruktionen af sekventeringsbiblioteker med høj gennemstrømning. De kan oprense DNA eller RNA, screene DNA-fragmenter i målstørrelse og berige målnukleinsyrer. Med udviklingen af sekventeringsteknologi er der opstået magnetiske perler, der er specialiseret i forskellige anvendelsesområder, herunder magnetiske perler til DNA-oprensning, magnetiske perler til udvælgelse af DNA-størrelse, magnetiske perler til RNA-oprensning og magnetiske perler til berigelse af mRNA. Så hvad er principperne for forskellige magnetiske perler? Hvordan vælger man?
Anmod om gratis prøve og lavere pris for bulkkøb
1. DNA-perler
2. Introduktion af stjerne-DNA-perler
3. RNA-oprensningskugler
4. mRNA-berigede magnetiske perler
5. Yeasen magnetiske perler produktanbefaling
1. DNA Perler
1.1 Grundlæggende principper
Princippet om oprensning af nukleinsyre med magnetiske perler er baseret på fast-fase reversibel immobilisering (SPRI). Under visse forhold er nukleinsyren selektivt bundet til de magnetiske perler, mens forurenende stoffer forbliver i opløsningen. Efter påføring af et magnetfelt adskilles de magnetiske perler, der binder til målmolekylerne, fra opløsningen, og derefter renses de magnetiske perler for yderligere at fjerne forurenende stoffer. Fordi kombinationen af magnetiske perler og nukleinsyremolekyler er reversibel, kan nukleinsyren elueres fra de magnetiske perler med en puffer med lavt saltindhold.
Den ydre overflade af magnetiske perler er modificeret med funktionelle siliciumhydroxyl- eller carboxylgrupper. I oprensningsbuffersystemet, der indeholder PEG og høje saltioner, bindes DNA med perler ved at danne en ionbro af DNA-saltioncarboxylgruppe. Denne binding er reversibel. Ionbroen fjernes i TE-bufferen uden PEG og saltioner, og til sidst oprenses DNA. Baseret på carboxylmagnetiske perler vil forskellige magnetiske perle-input og oprensningsbuffere binde forskellige fragmentstørrelser. De magnetiske perler binder fortrinsvis store fragmenter af DNA, så i første runde bruges magnetiske perler til at binde de fragmenter, der er større end målfragmentet, og supernatanten tilbageholdes; I anden runde binder de magnetiske perler målfragmentet i supernatanten og kasserer derefter supernatanten; Til sidst elueres målfragmentet fra de magnetiske perler, som DNA-fragmenterne har målstørrelsen.
Figur 1. Carboxyl magnetisk perlestruktur
Figur 2. Princip for DNA-oprensning magnetiske perler
1.2 Driftsproces
Figur 3. DNA-oprensningstrin
Figur 4. Trin til udvælgelse af DNA-størrelse
1.3 Tips til brug af magnetiske perler
Forbedret udbytte og præcis størrelsesvalg
(1) Bland godt før brug, og afbalancer de magnetiske perler til stuetemperatur i mindst 30 min.
——Opløseligheden af PEG i de magnetiske perler buffer påvirkes let af pH og temperatur.Før brug er det nødvendigt at afbalancere til stuetemperatur at lave de magnetiske perler jævnt suspenderet og PEG fuldstændigt opløst for at undgå at påvirke adsorptions- og separationseffekterne
(2) Adsorptionstiden skal være tilstrækkelig og fuldt blandet at gøre adsorptionen tilstrækkelig;
(3) Vask med 80% ethanol under oprensning eller adskillelse;
——Under 80 % ethanol er nukleinsyren dehydreret og opsamlet tæt og vil ikke opløses. De resterende enzymer, buffere, urenheder osv. i systemet renses med ethanol for at opnå en renere bibliotek.
(4) Under valg af størrelse skal prøvevolumenet bekræftes for at sikre, at det magnetiske perletilsætningsforhold er korrekt;
——Under størrelsesvalg er det nødvendigt at indtaste det tilsvarende volumen af magnetiske perler nøjagtigt, så andelen er nøjagtig, fordi ændringen af PEG og saltionkoncentrationen i bufferen kan påvirke resultaterne.
(5) Før elueringstrinnet, lad alkoholen fordampe fuldstændigt, men forhindre perlerne i overtørring
——Generelt kan det tørres på 2 ~ 3 min. Når antallet af magnetiske perler er stort og vanskeligt at tørre, Det anbefales at arbejde i flere centrifugerør.
(6) Hvis de magnetiske perler er agglomererede eller flækkede, er elueringstiden kan forlænges efter fuldstændig blanding;
——Det kan være forårsaget af urenheder i DNA eller for lang tørretid. Generelt, når der er mange urenheder i DNA, anbefales det at rense det først før størrelse valg.
2. Star DNA perler introduktion
Hieff NGS™ DNA-selektionsperler er baseret på princippet om SPRI (fastfase omvendt immobilisering), ved hjælp af importerede magnetiske perlerråmaterialer og et optimeret buffersystem, som kan bruges til DNA-fragmentstørrelseudvælgelse og oprensning under opbygningen af NGS-biblioteket. Det bruges på samme måde som de brugte AMPure XP-perler, og fragmentgendannelseseffektiviteten og biblioteksstørrelsesfordelingen er meget konsistente med dem.
2.1 Indførelse af rensningsydelse
- Unikt buffersystem: DNA-fragmenter ned til 50bp kan genvindes.
- Høj genvindingsgrad: ≥90%.
- Fjern effektivt urenheder: Fjern effektivt urenheder såsom primer dimer, dNTP, uorganisk salt og protein.
- Bredt anvendelsesområde: Velegnet til DNA-oprensning i scenarier som enzymfordøjelse, ligering, kloning og NGS-biblioteksopbygning.
Tabel 1. DNA-oprensning og genvindingseffektivitet af magnetiske perler med forskellige forhold
| Erfaringsgruppe | Gendannelseskoncentration af magnetiske perler i denne batch (ng/μL) | Gendannelsesrate | AMPure XP perlegruppe(ng/μl) ④ | Gendannelsesrate | CV % | |||
| Forhold | ① | ② | ③ | Gennemsnit | ||||
| 1,8× | 22.2 | 23.4 | 22.8 | 22.8 | 96,92 % | 22.2 | 94,37 % | 2,55 % |
| 0,8× | 20.2 | 19.3 | 18.5 | 19.33 | 82,19 % | 17.8 | 75,67 % | 6,52 % |
| 0,6× | 16.3 | 17.3 | 16.8 | 16.8 | 71,42 % | 16.2 | 68,87 % | 2,55 % |
Figur 5. Oprensningseffekt af magnetiske perler agarosegelelektroforese resultater
M：1kb DNA-stige;
2.2 Størrelse valg ydeevne
- Let til funktion: separationsprincippet og eksperimentel drift er fuldstændig i overensstemmelse med XP magnetiske perler
- Nøjagtig størrelsesvalg: Størrelsen af sorterede fragmenter er nøjagtig og stabil
- Bred anvendelighed: velegnet til bygning DNA- og RNA-biblioteker og tilpasning at fragmentere størrelsesudvælgelse af forskellige prøvetyper
- Ultra-høj omkostningsydelse: stabil kvalitet, mere økonomisk pris, mere hensynsfuld før- og eftersalgsservice
Figur 6. Resultater for valg af DNA-størrelse
3. RNA-oprensningskugler
Hieff NGS™ RNA-renser er baseret på SPRI-princippet, som effektivt kan fjerne proteiner, saltioner og andre urenheder for at opnå koncentrerede RNA-prøver med høj renhed og omhyggeligt optimere det sure buffersystem for at opretholde stabiliteten af RNA-strukturen og forhindre RNA-nedbrydning. Det er velegnet til RNA-bibliotekskonstruktion, oprensning af totale RNA-prøver efter rRNA-fjernelse, oprensning af RNA-produkter transskriberet in vitro, oprensning af RNA-mærkede produkter, oprensning af syntetisk RNA osv.
- Høj kvalitet: importerede råvarer, meget stabil kvalitet
- Optimeret buffersystem: sikre renhed og integritet af RNA og effektivt forhindre RNA-nedbrydning
- Høj effektivitet: effektiv genvinding, velegnet til RNA-bibliotekskonstruktion eller in vitro gendannelse af transskriptionsprodukt osv.
Figur 7. Elektroforetogram af forskellige prøver efter oprensning
4. mRNA-berigede magnetiske perler
4.1 Princip for mRNA-isolering
mRNA separation og berigelse magnetiske perler er magnetiske perler, der overflademodificeres med oligo (dT). Gennem hybridiseringsprincippet kan de specifikt binde mRNA med Poly A-hale og specifikt adskille mRNA fra totalt RNA eller vævsceller. Dette sæt med den optimerede produktformel kan effektivt isolere komplet mRNA med høj renhed fra RNA fra celler og væv fra dyr, planter, insekter og eukaryote mikroorganismer.
Figur 8.princippet om berigelse og oprensning af mRNA magnetiske perler
4.2 mRNA isolation perler ydeevne
Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit er uafhængigt udviklet af Yeasen til isolering af mRNA fra totalt RNA. mRNA-indfangningsperlerne er paramagnetiske mikrosfærer i mikronstørrelse modificeret med oligo (dT). Ved at kombinere med mRNA'et med poly (A) hale, isoleres mRNA'et og oprenses fra 10 ng-4 μg total RNA med god integritet.
- Høj effektivitet: mRNA-oprensning kan afsluttes inden for 45 min
- Høj renhed: oligo (dT) magnetiske perler binder specifikt mRNA
- Pålidelig: det opnåede mRNA er egnet til NGS, in vitro translation, RT-PCR og cDNA-syntese
Figur 9. Oprensning af mRNA-isoleringskit af mRNA fra forskellige RNA-prøver
Bemærk: husholdningsgenudbytte repræsenterer effekten af mRNA-gendannelse. rRNA-relateret genudbytte karakterisering rRNA fjernelse effektivitet
4.3 Ofte stillede spørgsmål om mRNA magnetiske perler
(1) Hvorfor agglomererer magnetiske perler, og hvordan løser man det?
——Magnetiske perler agglomeration vil reducere udbyttet og renheden af mRNA. Prøven kan indeholde mange urenheder, såsom polysaccharider, proteiner og langkædet DNA. Disse urenheder vil føre til magnetiske perler agglomeration. Løsningen er at blæse de magnetiske perler gennem en pipette. Genomisk DNA kan fjernes ved DNase-behandling før oprensning. Hvis den oprindelige prøvestørrelse er for stor og overstiger belastningen af de magnetiske perler, vil de magnetiske perler også agglomerere. Det anbefales at arbejde i henhold til inputmængden i manualen.
(2) Hvorfor er mRNA-udbyttet lavt?
——Der er mange årsager til lavt mRNA-udbytte:
- Cellers eller vævs mRNA-ekspressionsniveau er lavt, så vi kan vælge de passende ekspressionsperiodeprøver eller på passende vis øge prøvens totale RNA-inputmængde.
- Forholdet mellem magnetiske perler og prøver er for lavt, hvilket påvirker kombinationen af mRNA og magnetiske perler. Prøv at øge antallet af magnetiske perler eller reducere prøveinputmængden og volumen.
- Hybridiseringstiden er for kort, inkubationstiden kan øges til 10-15 minutter;
- Elueringen er utilstrækkelig, det er nødvendigt at øge volumen af elueringsbufferen på passende vis, øge elueringstiden og temperaturen eller gentage elueringstrinnet to gange.
(3) Hvordan eliminerer man rRNA effektivt?
——Hvis operationen er forkert, vil rRNA'et være uspecifikt bundet til de magnetiske perler sammen med mRNA'et under oprensningen, især når der er en stor mængde total RNA-input. To bindingsrunder bruges normalt i oprensningsprocessen for effektivt at undgå rRNA-forurening. Sørg for, at det er fuldt blandet under vaskeeksperimentet for at fjerne den ikke-specifikke binding og forsøge at fjerne rRNA-forurening.
(4) For mange downstream-applikationer, er det nødvendigt at eluere mRNA, og vil magnetiske perler interferere med downstream enzymreaktioner?
——Nogle nedstrømsreaktioner kan udføres direkte med magnetiske perler uden at eluere mRNA'er, såsom mRNA-fragmentering og omvendt transkription i RNA-biblioteksopbygning.Men hvis der skal udføres PCR-reaktioner, er det nødvendigt at sikre, at der ikke er en genomisk DNA-forurening, ellers vil der dannes mange genomiske amplifikationsfragmenter, som vil forstyrre forsøgsresultaterne. Detaljerede operationer kan udføres i henhold til instruktionerne fra tilsvarende nedstrømsreaktioner, såsom RNA-Seq bibliotekskonstruktion
(5) Kan sættet adskille mRNA direkte fra celler eller væv?
——Anbefales ikke! Lysatet indeholder nogle komponenter, som vil påvirke bindingen af mRNA. Det anbefales at bruge et specielt sæt.
5. Yeasen magnetiske perler produktanbefaling
Hieff NGS™-seriens magnetiske perler som Yeasen-stjerneprodukter har fremragende ydeevne og høj produktionskapacitet til at opfylde forskellige applikationer og erstatter problemfrit Beckman AMPure XP-perler. Siden lanceringen i 2018 har Yeasen magnetiske perler vundet et godt ry i branchen, og salget er fortsat med at stige. De er det bedste valg for god kvalitet og lav pris.
Tabel 2. Yeasen magnetiske perler produktanbefaling
| Produktnavn | Kat# | Specifikation | Brugs- og applikationsscenarier |
| Hieff NGS™ DNA-selektionsperler | 12601ES03 | 1 ml | 👉NGS DNA oprensning og størrelsesvalg 👉PCR produkt oprensning 👉Oprensning af enzymfordøjelses- og ligeringsprodukter |
| 12601ES08 | 5 ml | ||
| 12601ES56 | 60 ml | ||
| 12601ES75 | 450 ml | ||
| Hieff NGS™ RNA renser | 12602ES03 | 1 ml | 👉RNA oprensning 👉Oprensning af totale RNA-prøver efter rRNA-fjernelse 👉Oprensning af RNA-mærkede produkter |
| 12602ES08 | 5 ml | ||
| 12602ES56 | 60 ml | ||
| 12602ES75 | 450 ml | ||
| Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit | 12603ES24 | 24 T | 👉mRNA isolering og oprensning 👉In vitro transkription mRNA oprensning |
| 12603ES96 | 96 T |
Angående læsning
Hvor meget ved du om NGS-relateret teknologi?
5 minutter til at forstå fortiden og nutiden af DNA-selektionsperler (inklusive resultatanalyse og FAQ-fortolkning)