Liebe Freunde, fühlen Sie sich ratlos, wenn Sie beim Protein-Immunoblotting mit verschiedenen Loading Control- und Epitope Tagging Antibodies konfrontiert werden? Loading Control Proteine werden in Organismen durch Housekeeping-Gene kodiert und in mehreren Geweben stabil exprimiert. Sie werden verwendet, um zu überprüfen, ob immunologische Experimente normal verlaufen, und als halbquantitativer Nachweisstandard für die Proteinexpression. Wie wählt man also die richtigen Ladekontrollantikörper aus? Sie können sich auf die folgenden Punkte beziehen.
I. Herkunft der Probenart
- Wählen Sie für Proben aus Säugetiergewebe oder -zellen im Allgemeinen β-Actin, α-Tubulin, GAPDH, Lamin-B, Histon H3, Na+/K+-ATPase.
- Wählen Sie für pflanzliche Proben im Allgemeinen Pflanzenaktin, Rubisco usw.
- Wählen Sie für andere, weniger erforschte Proben das entsprechende Protein als interne Referenz aus, indem Sie die entsprechende Literatur oder Datenbanken konsultieren.
Stellen Sie sicher, dass sich das Molekulargewicht des Zielproteins von dem der Ladekontrolle unterscheidet um mehr als 5 kDa, um Störungen während der Erkennung zu vermeiden. Wenn das Zielprotein beispielsweise 40 kDa groß ist, ist es nicht geeignet, β-Actin (42 kDa) als Ladekontrolle zu wählen. Erwägen Sie die Verwendung von GAPDH (36 kDa) oder β-Tubulin (55 kDa) als Ladekontrolle.
III. Expressionsort des internen Referenzproteins
Hinweis: Vermeiden Sie die folgenden Situationen bei der Verwendung Laden von Kontrollantikörpern
| Subzelluläre Lokalisierung | Laden des Kontrollproteins | Molekulargewicht (KDa) | Hinweise |
| Zytoplasma, ganze Zelle | β-Aktin | 42 | Nicht für Kernextrakte geeignet. β-Actin ist ein Bestandteil von Chromatin-Remodeling-Komplexen; möglicherweise nicht geeignet für Situationen, in denen es zwischen den Forschungsteilnehmern erhebliche Altersunterschiede gibt. |
| α-Tubulin | 55 | Nicht geeignet für Situationen, in denen es erhebliche Altersunterschiede zwischen den Versuchsteilnehmern gibt. Die Expression von Tubulin verändert sich durch antimikrobielle und antimitotische Medikamente, daher ist es nicht geeignet, wenn Medikamente gegen Krebs und Pilzinfektionen hinzugefügt werden. | |
| β-Tubulin | 55 | ||
| GAPDH | 36 | Zellhypoxie führt zu einer erhöhten Expression von GAPDH und ist daher für Sauerstoffstudien nicht geeignet. Faktoren wie Diabetes können zu einer erhöhten Expression von GAPDH führen. | |
| Vinculin | 117 | Kann für Proteine mit hohem Molekulargewicht herangezogen werden. | |
| Mitochondrien | COXIV-Serie | 15-17 | Diese Proteinreihe konzentriert sich hauptsächlich auf 15-17 kDa. Wenn das Molekulargewicht des Zielproteins nahe daran liegt, sollten Sie andere Ladekontrollantikörper in Betracht ziehen. |
| HSP60 | 60 |
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| Kern | VDAC1/2 | 31-37 | Diese Proteinreihe konzentriert sich hauptsächlich auf 31–37 kDa. |
| Lamin B1 | 66 | Nicht geeignet für embryonale Stammzellen, nicht geeignet als Ladekontrolle in Apoptose-Experimenten. | |
| PCNA | 36 | Nicht für nicht proliferierende Zellen geeignet. | |
| TBP | 33-43 | TBP beträgt beim Menschen 37–43 kDa und bei Mäusen und Ratten 33–36 kDa und ist für Apoptose-Experimente nicht geeignet. | |
| YY1 | 65-70 |
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| Histon H3 | 17 | Die meisten Proteine haben ein Molekulargewicht von etwa 17 kDa. Wenn das Molekulargewicht des Zielproteins nahe daran liegt, sollten Sie andere Loadong-Kontrollantikörper in Betracht ziehen. | |
| Vollblut, Serum, Plasma | Transferrin | 77 | Die Expression wird durch bestimmte Krankheitszustände und Behandlungen, wie beispielsweise Retinsäure, beeinflusst. |
| Albumin | 66 | Der Gehalt ist extrem hoch, achten Sie bei WB-Experimenten auf eine Reduzierung der Probenbeladung. |
Markierte Antikörper wirken besser, wenn sie gemeinsam verwendet werden
In Experimenten zur Untersuchung von Proteininteraktionen, wie etwa Pull-down, können Epitop-Tags mithilfe molekularbiologischer Methoden an den N- oder C-Terminus des Zielproteins fusioniert werden. Häufig verwendete Epitop-Tags sind His, HA, Myc und GST. Diese Epitop-Tags beeinflussen normalerweise nicht die biologische Aktivität und die intrazelluläre Lokalisierung des Zielproteins. Die Einführung von Epitop-Tags hat die wissenschaftliche Forschung und die industrielle Produktion erleichtert.
| Epitop-Tag | Tag-Sequenz | Molekulargewicht (KDa) |
| HA Tag | : YPYDVPDYA | 1.1 |
| Myc Tag | EQKLISEEDL | 1.2 |
| Flag-Tag | DYKDDDDK | 1 |
| GST-Tag | - | 26 |
| GFP-Tag | - | 26,9 |
| V5 Tag | GKPIPNPLLGLDST | 1.4 |
| Hirsch | KETAAAKFERQHMDS | 1.8 |
| E-Tag | GAPVPYPDPLEPR | 1.4 |
Produktinformationen
| Typ | Produktname | Molekulargewicht (KDa) | Produktnummer |
| Kontrollantikörper wird geladen | β-Actin, Maus mAb | 42 | 30101ES |
| β-Aktin, Kaninchen pAb | 42 | 30102ES | |
| GAPDH (Klon:1A6), Maus-mAb | 36 | 30201ES | |
| GAPDH, Kaninchen pAb | 36 | 30202ES | |
| α-Tubulin, Maus mAb | 50-55 | 30304ES | |
| β-Tubulin, Maus mAb | 50-55 | 30301ES | |
| β-Tubulin, Kaninchen pAb | 50-55 | 30302ES |