1 Das Wirkprinzip von Geneticomycin

Genetomycin (Geneticin, G418) ist ein Aminoglykosid-Antibiotikum, das die Proteinsynthese hemmt, indem es die Peptidkettenverlängerung durch Bindung an die 70S- und 80S-Ribosomen in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen blockiert. Dieser Mechanismus ist toxisch für Bakterien, Hefen, Pflanzen und Säugetierzellen. Wenn die Zellen erfolgreich transfiziert und mit einem Neomycin-Resistenzgen (wie dem Neo-Gen) integriert wurden, konnte die genkodierte Aminoglykosid-Phosphotransferase (APH (3) II) G418 kovalent modifizieren, um es zu inaktivieren, wodurch Zellen, die in selektivem Medium mit G418 gewachsen sind, Resistenz verliehen wurde.

In molekulargenetischen Tests wird G418 häufig zur stabilen Transfektion eingesetzt.

2 Die Anwendung von Geneomycin

2.1 Screening stabiler transfizierter Zelllinien

• G418 wurde verwendet, um durch Hemmung der Proteinsynthese nach Zellen zu suchen, die Resistenzgene (z. B. Neogene) enthalten. Die vom Resistenzgen kodierte Aminoglykosidphosphotransferase inaktiviert G418, was den Zellen Resistenz gegen G418 verleiht. Der typische Screeningbereich für Säugetierzellen liegt bei 200 – 2000 μg/ml, wobei die am häufigsten verwendete Arbeitskonzentration 100 – 700 μg/ml beträgt. Während Pflanzenzellen 10–100 μg/ml und Hefezellen 500–1000 μg/ml aufweisen, sind die folgenden Konzentrationen für einige Zelltypen unter Verwendung von G418 als Referenz verwendet worden.

Zelle	Anwendung	Aktivierungskonzentration von Geneomycin (μg/ml)	Zitierte Werke
Mucor-Arten	a) Kultiviert in Wachstumsmedium b) Kultiviert auf lyophilisierten Bakterien	a) 10 μg/ml b) 30 μg/ml	Hirth, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 7356-7360 (1982).
Säugetier	a) Zur Vorführung b) Zur Aufrechterhaltung des Wachstums	a) 400 -1000 μg/mL b) 200 μg/ml	Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 5166-5170 (1982).
Anlage	a) Zur Vorführung b) Zur Aufrechterhaltung des Wachstums	a) 25-50 μg/ml b) 10 μg/ml	Ursic et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., v. 101:3, 1031-1037 (1981).
Hefe	a) Zur Vorführung b) Zur Aufrechterhaltung des Wachstums	a) 500 μg/ml b) 125-200 μg/mL	Jimenez und Davies, Natur, v. 287, 869-871 (1980).
Bakterien	Zum Screening	16 μg/ml	Waitz et al., Antimikrobielle Mittel Chemother., v. 6:5, 579-581 (1974).

2.2 Gen-Knockout und Gentransfer

• Beim Gen-Knockout kann G418 zum Screening von Zellen verwendet werden, die das Zielgen erfolgreich ausschalten. Beim Gentransfer erleichtert G418 die Integration fremder Gene in das Genom von Wirtszellen.

2.3 Resistenzselektion in der Zellkultur

• Während der Zellkultur wird G418 zum Screening auf gegen das Antibiotikum resistente Zellen verwendet, die häufig spezifische Resistenzgene in sich tragen.

3 Relevante experimentelle Verfahren für Geneomycin

3.1 Herstellung der G418-Stammlösung (50 mg/ml, aktive Konzentration)

1) Umrechnung von Leistungseinheiten

Umrechnung mit der Formel: (1000/A0) × A1 = A2, wobei A0 die Wirksamkeit von G418 ist, die je nach Charge variiert. Siehe den Qualitätskontrollbericht für die entsprechende Charge oder das Etikett auf der Flasche. A1 ist die gewünschte aktive Konzentration von G418, die hergestellt werden soll. A2 ist die tatsächliche Pulver-Volumen-Konzentration, die gewogen werden muss.

Wenn beispielsweise die Charge G418 eine Wirksamkeit von 750 U/mg hat und Sie eine aktive Konzentration von 50 mg/ml herstellen möchten, dann beträgt die tatsächlich herzustellende Pulverkonzentration 1000/750 × 50 mg/ml = 66,67 mg/ml.

Bei der Herstellung von 10 ml G418-Stammlösung (aktive Konzentration 50 mg/ml) werden 666,7 mg Pulver benötigt.

• Sterilisation und Lagerung

Basierend auf dem tatsächlichen Pulvergewicht, das Sie durch die obige Umrechnung erhalten haben, geben Sie es in 10 ml steriles deionisiertes Wasser, bis es vollständig aufgelöst ist.

Zunächst wird ein 0,22 μm Spritzenfilter mit 5 ml sterilem deionisiertem Wasser vorgefeuchtet, um das gesamte Wasser zu entfernen. Anschließend wird mit diesem Filter gefiltert, um die Probe zu sterilisieren und in kleine Mengen für den einmaligen Gebrauch (z. B. 1 ml) aufzuteilen. Die Probe wird bei -20 °C 1 Jahr lang haltbar gelagert.

3.2 Erstellung der Kill-Kurve

1) Erster Tag: Nicht transformierte Zellen mit einer Zelldichte von 20-25 % in geeigneten Kulturplatten plattieren und über Nacht bei 37 °C, CO₂.

2) Stellen Sie basierend auf dem Zelltyp einen Konzentrationsgradienten innerhalb eines geeigneten Bereichs ein und wählen Sie mindestens 6 Konzentrationen aus (G418 ist am aktivsten gegen Zellen in der Teilungsphase, daher sollten die Zellen vor der Zugabe von G418 eine Zeit lang kultiviert werden). Stellen Sie beispielsweise für Säugetierzellen 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/ml ein.

3) Zweiter Tag: Entfernen Sie das alte Kulturmedium und ersetzen Sie es durch ein frisch zubereitetes Medium mit der entsprechenden Konzentration des Arzneimittels, mit drei Replikaten für jede Konzentration.

4) Alle 3–4 Tage durch frisches, arzneimittelhaltiges Medium ersetzen.

5) Führen Sie in festgelegten Abständen (z. B. alle 2 Tage) Lebendzellzählungen durch, um die geeignete Konzentration zu ermitteln, die das Wachstum nicht transfizierter Zellen verhindert. Wählen Sie die niedrigste Konzentration, die die Mehrheit der Zellen innerhalb der idealen Anzahl von Tagen (normalerweise 7-10 Tage) abtöten kann, als Arbeitskonzentration für das Screening stabiler transfizierter Zelllinien.

3.3 Screening stabiler transfizierter Zellen

• Das von Yisheng Biotech bereitgestellte G418 Geneticin (60220ES) hat eine Wirksamkeit von ≥720 U/mg, eine Reinheit von ~98 % und Chargenstabilität und kostet fast ein Drittel des Preises der G418-Produkte anderer Unternehmen.
• Das Screeningmedium mit den Arzneimitteln wurde alle 3–4 Tage ausgetauscht.
• Die Bildung von Zellklonen (Kolonien) wurde nach 7 Tagen Selektion beobachtet und bewertet. Je nach Wirtszelltyp, Transfektion und Screening-Effektivität kann die Bildung von Kolonien eine Woche oder länger dauern.
• 5–10 resistente Klone wurden ausgewählt, auf 35-mm-Zellkulturplatten übertragen und weitere 7 Tage lang mit einem wirkstoffhaltigen Screeningmedium gehalten.
• Nach dem Wechsel der normalen Mediumkultur.

4 Produktempfehlung

Das G418 Geneticin (60220ES) bereitgestellt von Yeasen Biotech verfügt über eine Wirksamkeit von ≥720 U/mg, eine Reinheit von ~98 % und Chargenstabilität bei einem Preis von fast einem Drittel des Preises der G418-Produkte anderer Unternehmen.

Spezifikation	S*	T*	Yeasen	Yeasen-Vorteil
Inhalt (HPLC)	/	/	~98 %	Hohe Reinheit
Wirksamkeit (U/mg)	≥720 µg/mg	707-721 µg/mg	≥720 µg/mg	Hohe Wirksamkeit
Preis ($/5 g)	~1000	~1000	~200	Billigkeit

5 Experimenteller Fall

Bei E. coli handelte es sich bei G69 und G99 um zwei unterschiedliche Chargen; die Genomycin-Konzentrationen betrugen 8 mg/l, 12 mg/l bzw. 16 mg/l, und die wirksame Mindestkonzentration betrug 16 mg/l, wodurch das Wachstum verschiedener Bakterien vollständig gehemmt wurde.