Was ist Aureobasidin A
Aureobasidin A (AbA) ist ein zyklisches Peptidantibiotikum, das aus dem filamentösen Pilz Aureobasidium pullulans Nr. R106 isoliert wird. Es besitzt starke antimykotische Eigenschaften und kann in niedrigen Konzentrationen (0,1–0,5 μg/ml) für Hefe toxisch sein. Der Wirkungsmechanismus von AbA beruht auf der Hemmung der Aktivität der Inositolphosphorylceramid-Synthase (IPC-Synthase), eines Enzyms, das in Hefe durch das AUR1-Gen kodiert wird. Dadurch wird die Synthese von Ceramid zu Inositolphospholipiden blockiert, was zu einem Mangel an Sphingolipiden, einem Bruch der Zellmembran und damit zum Absterben des Stammes führt. Zu den Pilzarten, die empfindlich auf AbA reagieren, zählen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans und A. niger.
Abbildung 1 Strukturformel von AbA, CAS#127785-64-2
Untersuchungen haben ergeben, dass das AUR1-Gen von Saccharomyces cerevisiae und das AURA-Gen von Aspergillus nidulans homolog sind und beide IPC-Synthase kodieren. Daher können Mutationen in diesen beiden Genen Stämmen, wie dem mutierten Gen AUR1-C, eine starke AbA-Resistenz verleihen. AbA eignet sich sehr gut als Arzneimittelauswahlmarker zum Screening positiver Klone und erfordert keine Bedingungsoptimierung bei sehr geringem Hintergrund. Die AbA-Resistenz ist auch ein idealer Reporter für Hefe-Einzel-/Doppelhybridstudien und ist mit Hefe-Hybridsystemen kompatibel, die eine entsprechende Resistenz aufweisen.
Was ist das Hefe-Einzel-/Doppelhybridsystem
Das Hefe-Zwei-Hybrid-System (Hefe-Zwei-Hybrid-Assay) wurde von Fields und Song und anderen auf der Grundlage der Eigenschaften der eukaryotischen Transkriptionsregulierung entwickelt. Es kann die Wechselwirkungen zwischen bekannten Proteinen schnell und direkt analysieren und wird häufig zur Untersuchung von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen, zur Entdeckung neuer Proteine und neuer Proteinfunktionen, zum Screening von Arzneimittelzielen und zur Erstellung genomischer Proteinverbindungskarten verwendet. Das Prinzip des Hefe-Zwei-Hybrids besteht darin, dass der Transkriptionsaktivator von Eukaryoten zwei verschiedene Strukturdomänen enthält: die DNA-Bindungsdomäne (DNA-Bindungsdomäne, DNA-BD) und die DNA-Transkriptionsaktivierungsdomäne (Aktivierungsdomäne, AD), die unabhängig voneinander getrennt werden können, ohne die Funktion des jeweils anderen zu beeinträchtigen. BD und AD allein können die Transkriptionsreaktion nicht aktivieren. Nur wenn die beiden räumlich nahe genug beieinander liegen, zeigen sie die Aktivität eines vollständigen Transkriptionsaktivators, wodurch das nachgeschaltete Gen transkribiert werden kann. Durch die Konstruktion von Fusionsplasmiden der beiden untersuchten Proteine (Protein X und Protein Y) mit BD- bzw. AD-Domänen und deren Expression in der gleichen Hefezelle wird das Reportergen nicht transkribiert, wenn keine Interaktion zwischen den beiden Proteinen stattfindet. Wenn die beiden Proteine interagieren, liegen die BD- und AD-Domänen räumlich nahe beieinander, sodass das Reportergen transkribiert wird.
Abbildung 2 Prinzipdiagramm des Hefe-Zwei-Hybrids [1]
Die Hefe-Ein-Hybrid-Technologie ist ein Werkzeug zum Studium der Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäure und Protein, das auf der Grundlage der Hefe-Zwei-Hybrid-Technologie entwickelt wurde und weithin zum Studium der Expressionsregulierung von Genen in eukaryotischen Zellen verwendet wird, beispielsweise um festzustellen, ob eine Wechselwirkung zwischen bekannter DNA und bekannten Proteinen besteht; um neue Proteine zu isolieren, die an das Ziel-cis-regulatorische Element oder andere kurze DNA-Bindungsstellen binden; um die DNA-Bindungsstellen, bei denen eine Wechselwirkung nachgewiesen wurde, genau zu lokalisieren und um die DNA-Bindungsdomänen von Proteinen zu analysieren. Das Grundprinzip besteht darin, das bekannte cis-wirkende Element vor dem grundlegendsten Promotor (Minimalpromotor, Pmin) zu konstruieren und das Reportergen hinter Pmin anzuschließen. Die cDNA, die den zu testenden Transkriptionsfaktor kodiert, wird mit dem Hefe-AD-Domänen-Expressionsvektor fusioniert und in Hefezellen eingeführt.Wenn das Produkt dieses Gens an das cis-wirkende Element binden kann, kann es den Pmin-Promotor aktivieren, wodurch die Expression des Reportergens ermöglicht wird.
Abbildung 3 Prinzipdiagramm des Hefe-Einhybrids [2]
Für Hefe-Einzel-/Doppelhybridstudien bietet
| BBakterienstamm | MIKROFON (Ng/ml) | |
| S. cerevisiae | ATCC9763 (diploid) | 200-400 |
| SH3328 (haploid) | 100 | |
| Sake-Hefe (diploid) | 100-200 | |
| Shochu Hefe (diploid) | 100 | |
| Bierhefe (triploid oder tetraploid) | 100 | |
| Backhefe (diploid) | 200-400 | |
| Schizo.pombe | JY-745 (monoploid) | 100 |
| C. albicans | TIMM-0136 (diploid) | 40 |
| C.tropicalis | TIMM-0324 (diploid) | 80 |
Anwendungsfall
Um die Bindungsstelle des GmWRKY31-Proteins am Promotor des GmSAGT1-Gens zu untersuchen, wurde im Hefe-One-Hybrid-Experiment die Ziel-DNA-Sequenz in den pBait-AbAi-Vektor eingefügt, der das Uracil-Reportergen Ura3 enthält, das sich vor dem AUR1-C-Gen befindet. Nach der Hefetransformation mit dem entsprechenden Plasmid wurde es in einer 0,9%igen NaCl-Lösung suspendiert und die OD600 auf 0,005 eingestellt. Anschließend wurden 100 μl der Probe auf Platten mit 500 ng/ml AbA verteilt, umgedreht und 3–5 Tage lang bei 30 °C kultiviert.[3].
Abbildung 3 Interaktion des GmWRKY31-Proteins mit Hefestämmen, die die Fragmente F16, F20, F73, delF16, delF20 oder delF73 enthalten.
Veröffentlichte Artikel mit unseren Reagenzien
[1] Shunan Zhang, Yuyi Zhang, Kangning Li, et al. Stickstoff vermittelt Blütezeit und Stickstoffnutzungseffizienz über Blütenregulatoren in Reis, Current Biology, Band 31, Ausgabe 4, 2021, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.095. (WENN:10.834)
[2] Jiaying Kuang, Yingchun Xu, Yidan Liu, et al. Ein NnSnRK1-zentriertes regulatorisches Netzwerk zur schattenbedingten vorzeitigen Beendigung der Blüte bei Lotus, Environmental and Experimental Botany, Band 221, 2024, 105725, https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2024.105725. (WENN:5.7)
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| Polymyxin B-Sulfat | 60242ES03/10 | 1/10MU |
Referenzdokumentation
[1] Paiano A, et al. Hefe-Zwei-Hybrid-Assay zur Identifizierung interagierender Proteine.Curr Protoc Protein Sci. 2019 Feb;95(1):e70.
[2] John S, et al. Hefe-Ein-Hybrid-Assays: eine historische und technische Perspektive.Methoden. 2012 August;57(4): 441-447.
[3] Dong H, et al. Transkriptomanalyse von Sojabohnen-WRKY-TFs als Reaktion auf eine Infektion mit Peronospora manshurica. Genomics. 2019 Dez;111(6):1412-1422.