1 AFunktionsprinzip

Hygromycin B ist ein Aminoglykosid-Antibiotikum, das durch den Stoffwechsel von Streptomyces hygroscopicus produziert wird. Es hemmt die Proteinsynthese, indem es die Translokation stört und die Fehllesung von 80S-Ribosomen fördert und dadurch prokaryotische und eukaryotische Zellen tötet.

Derzeit wird es häufig zum Screening und zur Erhaltung prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen verwendet, die ein Hygromycin-Resistenzgen enthalten.

2 Anwendung

2.1Screening und Kulturpflege von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen (Pflanzenzellen und Säugetierzellen), die stabil mit Hph transfiziert wurden+Vektoren

Das Hygromycin B Resistenzgen (hyg oder hph) aus Escherichia coli. kodiert Hygromycin B-Phosphotransferase, die Hygromycin B in ein biologisch inaktives phosphoryliertes Produkt umwandelt und dadurch entgiftet. Im Hinblick auf dieses Prinzip ist Hygromycin B ein sehr nützlicher Selektionsmarker für die Untersuchung und Erhaltung kultivierter prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen, die erfolgreich mit dem Hygromycin-Resistenzgen transfiziert wurden.

2.2 Aufgrund der unterschiedlichen Wirkungsweise wird Hygromycin B häufig in Kombination mit Geneticin G418, Bleomycin und Blasticidin S verwendet, um Zelllinien zu screenen, die stabil mit zwei verschiedenen Vektoren transfiziert wurden.

Hygromycin B hat eine andere Wirkungsweise als G418 (Kat.-Nr. 60220ES) und Bleomycin (Kat.-Nr. 60257ES). und Blasticidine (Kat.-Nr. 60218ES), daher eignet es sich gut für die Verwendung in Kombination mit anderen selektiven Antibiotika in Doppelselektionsexperimenten.

2.3 Antivirales Mittel
2.4 Als Anthelminthikum wird es dem Tierfutter zugesetzt und Tiere werden damit gezüchtet.
2.5 Screening stabil transfizierter Zellen

Die Arbeitskonzentration von Hygromycin B, die zum Screening stabiler Transfektanten verwendet wird, variiert je nach Zelltyp, Medium, Wachstumsbedingungen und Zellstoffwechselrate. Die empfohlene Konzentration beträgt 50–1000 μg/ml. Für die erste Verwendung des experimentellen Systems wird empfohlen, die optimale Screening-Konzentration durch die Erstellung einer Abtötungskurve, d. h. einer Dosis-Wirkungs-Kurve, zu bestimmen. Im Allgemeinen 50–500 μg/ml für Säugetierzellen; 20–200 μg/ml für Bakterien/Pflanzenzellen; 200–1000 μg/ml für Pilze.

3 Protokoll

3.1 Herstellung der Aufbewahrungslösung (50 mg/mL)

Wiegen Sie 0,5 g Hygromycin B ab und fügen Sie 10 ml 1×PBS, pH 7,4 hinzu. Nach vollständiger Auflösung zur Sterilisation mit einem 0,22-μm-Filter filtrieren. Die sterilisierte Lösung aliquotieren und bei -20 °C lagern.

3.2 Häufig verwendete Screening-Konzentration

Die Arbeitskonzentration von Hygromycin B zum Screening stabiler Stämme variiert je nach Zelltyp, Kulturmedium, Wachstumsbedingungen und Zellstoffwechselrate. Es wird empfohlen, eine Abtötungskurve (Dosis-Wirkungs-Kurve) zu erstellen, um die optimale Screening-Konzentration erstmals zu bestimmen. Im Allgemeinen Säugetierzellen: 50–500 μg/ml; Bakterien-/Pflanzenzellen: 20–200 μg/ml; Pilze: 300–1000 μg/ml.

3.3 Festlegung der Abtötungskurve

【Hinweis】 Um stabile Zelllinien zu screenen, ist es notwendig, die Mindestkonzentration an Antibiotika zu bestimmen, die in der Lage ist, nicht transfizierte Wirtszellen abzutöten. Dies kann durch die Erstellung einer Abtötungskurve (Dosis-Wirkungs-Kurve) erreicht werden. Es sollten mindestens fünf Konzentrationen festgelegt werden.

1) Tag 1: Nicht-transformierte Zellen werden in einer geeigneten Kulturplatte mit einer Zelldichte von 20–25 % ausgesät und über Nacht kultiviert.【Hinweis】 Die Menge der Inokulationszellen kann für Zellen erhöht werden, die eine höhere Dichte benötigen, um ihre Vitalität festzustellen.

2) Stellen Sie den Konzentrationsgradienten je nach Zelltyp im entsprechenden Bereich ein. Bei Säugetierzellen sind 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/ml möglich. Verdünnen Sie die Hygromycin B-Lösung 1:10 mit deionisiertem Wasser oder PBS-Puffer auf 5 mg/ml. Verdünnen Sie die Lösung dann gemäß der folgenden Tabelle auf die entsprechende Arbeitskonzentration.

Endkonzentration (μg/mL)	Mittleres Volumen (ml)	Zugabevolumen von 5 mg/ml Hygromycin B (ml)
50	9.9	0,1
100	9,8	0,2
250	9,5	0,5
500	9,0	1.0
750	8,5	1.5
1000	8,0	2.0

3) Tag 2: Ersetzen Sie es durch ein frisch zubereitetes Medium mit der entsprechenden Konzentration des Arzneimittels. Machen Sie für jede Konzentration drei parallele Proben.

4) Alle 3–4 Tage durch frisches Medium mit Arzneimitteln ersetzen.

5) Lebende Zellzählungen werden in einem festen Zyklus (z. B. alle 2 Tage) durchgeführt, um die geeignete Konzentration zu bestimmen, die das Wachstum nicht transfizierter Zellen verhindert. Wählen Sie die Mindestkonzentration, die die Mehrheit der Zellen innerhalb einer idealen Anzahl von Tagen (normalerweise 7-10 Tage) abtötet, als Arbeitskonzentration für das Screening stabiler Zelllinien.

3.4 Screening stabiler transfizierter Zellen

1) 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit einem Screeningmedium subkultiviert, das Hygromycin B in geeigneter Konzentration (direkt oder verdünnt) enthielt. 【Hinweis】 Antibiotika wirken am besten bei sich aktiv teilenden Zellen. Wenn die Zellen zu dicht sind, tötet das Antibiotikum die Zellen nicht ab. Teilen Sie die Zellen so, dass die Konfluenz der Zellen nicht mehr als 25 % beträgt.

2) Wechseln Sie das Screening-Medium alle 3–4 Tage.

3) Messen Sie die Zellkoloniebildung nach 7 Tagen Screening. Die Koloniebildung kann je nach Wirtszelltyp, Transfektion und Screeningeffektivität eine weitere Woche oder länger dauern.

4) Wählen Sie 5–10 resistente Klone aus, übertragen Sie sie auf 35-mm-Zellkulturplatten und kultivieren Sie sie 7 Tage lang in einem wirkstoffhaltigen Screeningmedium.

5) Durch frisches Medium ohne Arzneimittel für die Kultur ersetzen.

4 Eigenschaften

Hygromycin B ist ein weißes bis gelblich-braunes Pulver mit einem besonderen Geruch, das leicht in Wasser, Methanol, Ethanol usw. löslich ist und mit vielen organischen und anorganischen Säuren leicht Salze bildet.

5 Lagerung der Produkte

Die Lösung kann direkt bei 2–8 °C gelagert werden und ist über 6 Monate haltbar.

6 Achtung

1) Die mit dem hph-Gen transfizierten Zellen sind resistent gegen Hygromycin und die transfizierten Zellen exprimieren das Gen stabil oder vorübergehend.

2) Das Hygromycin-B-Resistenzgen (hyg oder hph) wurde neben E. Coli auch in anderen Stämmen gefunden, darunter Streptomyces hygroscopicus und Klebsiella pneumoniae.

7 Produktempfehlung

Yeasen bietet Hygromycin B in zwei Formen, Pulver (1 g/10 g, Kat.-Nr. 60225ES) und Lösung (50 mg/ml, Kat.-Nr. 60224ES).

Produktname	Katze#	Spezifikation
Hygromycin B (50 mg/ml)	60224ES03	1 g (20 ml)
	60224ES10	10×1 g (20 ml)
Hygromycin B	60225ES03	1 g
	60225ES10	10 g

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Hygromycin B (50 mg/ml)	60224ES03	1 g (20 ml)/10×1 g (20 ml)
Hygromycin B	60225ES03/10	1/10 g
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