Apoptose bezeichnet im Allgemeinen eine Art programmierten Zelltod, der durch die Regulierung intrazellulärer Gene und ihrer Produkte während der Zellentwicklung oder unter Einwirkung bestimmter Faktoren auftritt. Apoptose spielt eine wichtige Rolle bei der Embryonalentwicklung und Morphogenese, der Stabilität normaler Zellpopulationen in Geweben, der Abwehr und Immunantwort des Körpers, bei Zellschäden und Alterung durch Krankheit oder Vergiftung sowie bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Tumoren und hat eine potenzielle therapeutische Bedeutung.

Die Ereignisse im apoptotischen Pfad erfolgen in einer zeitlichen Abfolge, das heißt, die Ereignisse treten nacheinander auf und führen schließlich zur Entstehung apoptotischer Körper und zum Auftreten der Apoptose.

Seine typischen Merkmale sind wie folgt:

1. Frühe Apoptose: Veränderungen der Zellmembranstruktur, Phosphatidylserin-Eversion;

2. Apoptose im frühen und mittleren Stadium: Die Dichte des Zytoplasmas nahm zu, das mitochondriale Membranpotential verschwand, die Permeabilität veränderte sich und Cytochrom C wurde in das Zytoplasma freigesetzt.

3. Späte Apoptose: Apoptose-Signaltransduktion;

4. Späte Apoptose: DNA degradiert auf Fragmentgröße von 180–200 bp.

Abbildung 1: Auftreten und Erkennung von sequentiellen Ereignissen im Apoptosepfad

1. Frühe Apoptose: Annexin-V/PI Doppelfärbung (Nachweis von PS auf der extrazellulären Membran)

In normalen lebenden Zellen befindet sich Phosphatidylserin (PS) auf der Innenseite der Zellmembran. Bei Apoptose verändert sich die Zellmembran und PS kippt von der Innenfläche der Zellmembran zur Außenfläche der Zellmembran. Annexin-V ist ein Ca2+-abhängiges Phospholipid-Bindungsprotein mit einem Molekulargewicht von 35-36 KD, das mit hoher Affinität an PS binden kann. Mit mit Fluorescein (FITC, Alexa fluor488 usw.) markiertem Annexin-V als Sonde können apoptotische Zellen und lebende Zellen mittels Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskop identifiziert werden.

PS nekrotischer Zellen wird auch von der inneren Oberfläche der Zellmembran auf die äußere Oberfläche der Zellmembran übertragen. Annexin-V kann auch PS auf der Oberfläche nekrotischer Zellen erkennen, sodass Annexin-V nekrotische Zellen nicht von apoptotischen Zellen unterscheiden kann. Darüber hinaus ist Propidiniodid (PI) ein Nukleinsäurefarbstoff, der an DNA in Zellen binden kann und nicht die gesamte Zellmembran durchdringen kann. Die Zellmembran von frühen apoptotischen Zellen und lebenden Zellen ist noch intakt, und PI-Farbstoff kann nicht frei durch die Zellmembran in die Zelle eindringen, um an DNA zu binden, sodass PI-Farbstoff apoptotische Zellen und lebende Zellen nicht markieren kann, aber PI-Farbstoff kann durch die Zellmembran nekrotischer Zellen an DNA in der Zelle binden. PI-Farbstoff in den toten Zellen emittiert nach Anregung durch einen 488-nm-Laser eine rote Fluoreszenz und wird vom entsprechenden Kanal empfangen. Daher können Annexin V und PI zusammen verwendet werden, um lebende Zellen, frühe apoptotische Zellen und nekrotische Zellen zu unterscheiden.

Abbildung 2: Analyse der Durchflusszytometrie-Ergebnisse nach Annexin-v/pi-Doppelfärbung

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2. Frühe Apoptose: JC-1-Färbung (Nachweis von Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials)

Der Prozess der Apoptose geht häufig mit der Zerstörung des mitochondrialen Transmembranpotentials einher, was allgemein als eines der frühesten Ereignisse im Prozess der Apoptosekaskade angesehen wird. Es tritt auf, bevor die Merkmale der nuklearen Apoptose (Chromatinkonzentration, DNA-Bruch) auftreten. Sobald das mitochondriale Transmembranpotential zusammenbricht, ist die Zellapoptose irreversibel. Die Existenz des mitochondrialen Transmembranpotentials ermöglicht es einigen lipophilen kationischen Fluoreszenzfarbstoffen wie Rhodamin 123, JC-1, JC-10, an die mitochondriale Matrix zu binden. Die Zunahme oder Abnahme ihrer Fluoreszenz zeigt die Zunahme oder Abnahme der Elektronegativität der mitochondrialen Innenmembran an.

JC-1 wird häufig verwendet, um das mitochondriale Membranpotential △ΨM zu erkennen und zeigt eine potentialabhängige Akkumulation in Mitochondrien. In normalen Mitochondrien aggregiert JC-1 in der mitochondrialen Matrix und bildet ein Polymer, das eine starke rote Fluoreszenz aussendet (ex=585 nm, em=590 nm). In apoptotischen Zellen wurde das mitochondriale Transmembranpotential depolarisiert, JC-1 wurde aus den Mitochondrien freigesetzt, die Konzentration nahm ab und es kehrte in die monomere Form zurück, die eine grüne Fluoreszenz aussendet. Daher spiegelt die Farbänderung direkt die Änderung des mitochondrialen Membranpotentials wider. Der Grad der mitochondrialen Depolarisation kann auch durch das Verhältnis der roten/grünen Fluoreszenzintensität gemessen werden. Die JC-1-Erkennung ist eine gängige Methode.

3. Späte Apoptose: TUNEL-Methode (DNA-Fragment-In-situ-Labeling-Methode)

Im Spätstadium der Apoptose entstehen aufgrund von Doppelstrangbrüchen oder Einzelstrangbrüchen der chromosomalen DNA viele klebrige 3-OH-Enden. Unter der Einwirkung der Desoxyribonukleotid-Terminaltransferase (TdT) kann mit Luciferase markiertes dUTP an das 3-Terminus der DNA gebunden werden, sodass apoptotische Zellen erkannt werden können. Solche Methoden werden als terminale Desoxynukleotidyltransferase-vermittelte dUTP-Nick-End-Markierung (TUNEL) bezeichnet. Da normale oder proliferierende Zellen fast keine DNA-Brüche aufweisen, kommt es nicht zur 3-OH-Bildung und nur wenige können gefärbt werden. TUNEL ist eigentlich eine Forschungsmethode, die Molekularbiologie und Morphologie kombiniert. Die In-situ-Färbung eines vollständigen einzelnen apoptotischen Kerns oder apoptotischen Körpers kann die typischen biochemischen und morphologischen Merkmale der Apoptose genau widerspiegeln. Damit lässt sich die Zellmorphologie von in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten, gefrorenen Gewebeschnitten, kultivierten Zellen und aus Geweben isolierten Zellen bestimmen und eine sehr kleine Anzahl apoptotischer Zellen erkennen. Daher wird es häufig bei der Untersuchung der Apoptose eingesetzt.

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