1. Was sind dendritische Zellen (DC)?
Dendritische Zellen (DCs) sind die wirksamsten Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) im menschlichen Körper. DCs sind die einzigen APCs, die die Proliferation naiver T-Zellen stark stimulieren können. Andere Arten von APCs (wie Monozyten, Makrophagen, B-Zellen usw.) können nur aktivierte oder Gedächtnis-T-Zellen stimulieren. Daher sind DC-Zellen die Initiatoren adaptiver T-Zell-Immunreaktionen und spielen eine äußerst wichtige Rolle bei der Tumorimmunität. DC-Zellen exprimieren stark MHC-I- und MHC-II-Moleküle auf ihrer Oberfläche und verfügen über spezifische Oberflächenmarker. Sie nehmen T-Zellen auf, verarbeiten und stimulieren sie, um Antigene zu aktivieren, und bestimmen letztendlich die Differenzierungsrichtung der T-Zellen.
2. Gleichstromquelle
DC-Zellen sind im Körper nur in sehr geringen Mengen vorhanden. Es dauert lange, DC direkt aus dem Körper zu isolieren, und die Zellausbeute ist sehr gering, was die Forschung und Anwendung von DC stark einschränkt. DC können jedoch aus DC-Vorläuferzellen in verschiedenen Geweben differenziert und induziert werden, wie z. B. Vorläuferzellen in Knochenmarkflüssigkeit, Monozyten im peripheren Blut und Nabelschnurblut.
Da menschliches peripheres Blut am einfachsten zu gewinnen ist und die größte Anzahl an Monozyten enthält, wird beim Menschen am häufigsten die DC aus menschlichen mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMC) induziert. Bei Mäusen werden DC am häufigsten aus Knochenmarkszellen, nämlich aus Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (BMDC), induziert.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der klassischen BMDC-Herstellungsmethode
3. BMDC-Vorbereitungsmethode
Gängige Methoden zur Herstellung von Maus-BMDCs sind:
3.1 Klassische BMDC-Kulturmethode - Inaba-Methode (modifiziert)
3.2 Großtechnische Herstellung von BMDC - Sons-Methode
3.3 Großtechnische Herstellung von BMDC - Lutz-Methode
3.1 [Klassische BMDC-Kulturmethode] - Inaba-Methode (verbessert)
【Hintergrund】
A. Die Anzahl der mit der Inaba-Methode erhaltenen BMDCs beträgt 5-7 x 106/Maus;
B. Die ursprüngliche Inaba-Methode verwendet nur GM-CSF, um die Produktion von BMDCs zu induzieren. Obwohl die erhaltenen BMDCs eine starke stimulierende Wirkung auf die gemischte Lymphozytenreaktion haben, ist die Reife der DCs nicht so gut wie bei der kombinierten Induktion von GM-CSF+IL-4. Daher wird bei der nachfolgenden verbesserten Methode häufig die kombinierte Induktion von GM-CSF+IL-4 verwendet.
【Anbauschritte】
3.1.1 Gewinnung von Knochenmarkszellen von Mäusen
1) Mäuse (6–10 Wochen alt) wurden durch Genickbruch getötet, sämtliche Oberschenkel- und Schienbeinknochen wurden operativ entfernt und das Muskelgewebe um die Knochen herum wurde so weit wie möglich mit Scheren und Zangen entfernt.
[Notiz] Die Knochen nicht beschädigen.
2) Legen Sie den Knochen auf die saubere Werkbank und legen Sie ihn zum Desinfizieren und Sterilisieren 2–5 Minuten lang in eine sterile Kulturschale mit 70 % Alkohol. Waschen Sie ihn anschließend zweimal mit sterilem PBS.
3) Legen Sie den Knochen in eine neue Kulturschale mit PBS, schneiden Sie die beiden Enden des Knochens mit einer Schere ab und entnehmen Sie das PBS mit einer Spritze. Führen Sie die Nadel von beiden Enden des Knochens in die Knochenmarkhöhle ein und spülen Sie das Knochenmark wiederholt in die Kulturschale, bis der Knochen vollständig weiß wird.
4) Sammeln Sie die Knochenmarksuspension und filtern Sie mit einem 200-Maschen-Nylonnetz kleine Fragmente und Muskelgewebe heraus.
5) Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 1200 U/min für 5 Minuten und den Überstand verwerfen.
6) 2 ml Ammoniumchlorid-Lysepuffer für rote Blutkörperchen (1x) zugeben, die Zellen resuspendieren und bei Raumtemperatur für 3-5 Minuten, bis zu 10 Mindest.
7) 10 ml PBS zugeben, um die Wirkung des Lysepuffers zu neutralisieren, dann bei 1200 U/min zentrifugieren für 5 Minuten und den Überstand verwerfen.
8) Einmal mit PBS waschen und die Zellen dann im RPMI1640-Kulturmedium mit 10 % FBS resuspendieren. Es wurden Knochenmarkszellen von Mäusen gewonnen.
Herstellung einer Ammoniumchlorid-Lösung zur Lyse roter Blutkörperchen:
A. Bereiten Sie die 10x-Speicherlösung wie folgt vor: Wiegen Sie 82,9 g NH4Cl, 10,0 g KHCO3 und 0,37 g Na2EDTA, in 1L destilliertem Wasser lösen, mit 0,22 filtrieren μm-Filtermembran sterilisieren und 6 Monate bei 4 °C lagern;
B. Vor Gebrauch die 10x Aufbewahrungslösung mit sterilem destilliertem Wasser im Verhältnis 1:9 zur 1x Arbeitslösung verdünnen.
[Notiz] Da die Ammoniumchlorid-Lösung zur Lyse roter Blutkörperchen eine gewisse schädliche Wirkung auf Knochenmarkszellen hat, sollte die Hämolysezeit so weit wie möglich verkürzt werden.
3.1.2 Induktion der BMDC-Differenzierung
1) Zählen Sie die in Schritt 1 gewonnenen Knochenmarkszellen der Maus und stellen Sie die Zellkonzentration auf 0,5-1× 10 ein.6/ml mit RPMI 1640-Komplettkulturmedium, das 10 % FBS enthält.
2) In eine 24-Well-Kulturplatte geben, 1 ml Zellen pro Well, rekombinanten Maus-GM-CSF (20 ng/ml) und IL-4 (10 ng/ml) und Kultur in einer 37℃, 5% CO2 Inkubator. Dies ist der 0. Tag der Kultur.
【Notiz】
A. Im Allgemeinen etwa 4-5x107 Knochenmarkszellen können von einer Maus geerntet werden, sodass mindestens 40–50 Vertiefungen einer 24-Well-Platte beschichtet werden können.
B. Die Konzentrationsbereiche von GM-CSF und IL-4 liegen bei 20-50 ng/ml und 10-40 ng/ml, jeweils.
3) Schütteln Sie die Kulturplatte alle 2 Tage vorsichtig, ersetzen Sie dann 3/4 des Volumens durch frisches Kulturmedium und füllen Sie die Zytokine wieder auf.
4) Blasen Sie zwischen dem 5. und 8. Tag vorsichtig durch das Kulturmedium, um suspendierte Zellen und lose anhaftende Zellen zu sammeln.
5) Zentrifugieren bei 1200 U/min für 5 Minuten und den Überstand verwerfen.
6) Resuspendieren Sie die Zellen in RPMI 1640-Komplettkulturmedium mit 10 % FBS und zählen Sie sie. Stellen Sie dann die Zellkonzentration auf 1×10 ein.6/ml, und fügen Sie rekombinanten Maus GM-CSF (20 ng/ml) und IL-4 (10 ng/ml).
7) Platieren Sie die Zellen in 100-mm-Kulturschalen (bis zu 10 ml pro Schale) oder 6-Well-Kulturplatten (2 m²/Well).
8) Weiter kultivieren bei 37℃, 5% CO2 Inkubator für 1-2 Tage.
9) Sammeln Sie die suspendierten Zellen, bei denen es sich um die reiferen BMDCs handelt.
【Notiz】
A. Bei den Schritten 2.5 bis 2.8 handelt es sich um Neubeschichtungsschritte, deren Zweck darin besteht, dem in Schritt 2.4 erhaltenen BMDC einen reiferen Charakter zu verleihen.
B. Innerhalb von drei Stunden nach dem erneuten Ausplattieren sind viele stachelige anhaftende Zellen zu sehen, die aus den DC-Clustern migrieren. Nach einem Tag der Kultur wird man feststellen, dass sich diese anhaftenden Zellen vom Boden der Kulturplatte gelöst haben und viele typische DCs im Kulturmedium schwimmen.
3.1.3 Vollständige Reifung von BMDC
[Hinweis] Die in Schritt 2 erhaltenen BMDCs sind keine vollständig reifen DCs. Wenn Sie vollständig reife DCs erhalten möchten, müssen Sie noch durch LPS, CD40L oder TNF-a induziert werden.
1) Zentrifugieren Sie das in Schritt 2.4 oder 2.9 erhaltene BMDC bei 1200 U/min für 5 Minuten und den Überstand verwerfen.
2) Resuspendieren Sie den Niederschlag mit RPMI-Komplettkulturmedium, das rekombinanten Maus-GM-CSF enthält (20 ng/ml) und IL-4 (10 ng/ml) und stellen Sie die Zellkonzentration auf 1×10 ein6/ml nach dem Zählen.
3) Zu 24-Well-Kulturplatten hinzufügen und Reifungsinduktoren wie TNF-α (250 U/ml), LPS (1 μg/mL) oder CD40L (1 μg/mL).
4) Kultur in einem 37℃, 5% CO2 Inkubator für 2 Tage.
5) Sammeln Sie die suspendierten Zellen und die Zellen, die lose an der Wand haften. Dabei handelt es sich um reife dendritische Zellen.
3.2【BMDC-Massenproduktionsverfahren】-Son-Methode
【Hintergrund】
A. Mit dieser Methode können 30-40×10 erreicht werden6 DC/Maus innerhalb von 7 Tagen, was 7-10 Mal so viel ist wie bei der klassischen Inaba-Methode. Nachdem DC durch einen 14,5 %igen Metrizamid-Gradienten zentrifugiert wurde, kann die Reinheit (d. h. CD11c+/I-Ab+-Zellen) 85-95 % erreichen.
B. Die Endozytosefähigkeit der mit dieser Methode gewonnenen DC ist schwächer als bei der klassischen Inaba-Methode, die Menge des abgesonderten IL-12p70 ist jedoch ähnlich.
C. Mit dieser Methode gewonnene DC verfügen über eine stärkere Stimulationsfähigkeit bei gemischten Lymphozytenreaktionen als die klassische Inaba-Methode.
D. Mit dieser Methode gewonnene DC können eine stärkere spezifische T-Zell-Reaktion auslösen.
f. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit der Son-Methode mehr und ausgereiftere BMDC erzielt werden können als mit der klassischen Methode.
【Anbauschritte】
3.2.1 Gewinnung von Maus-Knochenmarkszellen
Siehe die entsprechenden Schritte in der Inaba-Methode (modifiziert).
3.2.2 Herstellung großer Mengen BMDC
1) Zählen Sie die in Schritt 1 erhaltenen Knochenmarkszellen der Maus und stellen Sie die Zellkonzentration auf 2×10 ein.5/ml mit RPMI 1640 Komplettkulturmedium mit 10% FBS.
2) In 6-Well-Kulturplatten verteilen, 5ml Zellen pro Well, rekombinanten Maus-GM-CSF hinzufügen (1000 U/ml) und IL-4 (1000 U/ml) und Kultur in einer 37℃, 5% CO2 Inkubator.
3) Am vierten Tag der Kultur wird das Kultursystem mit rekombinantem Maus-GM-CSF (1000 U/ml) und IL-4 (1000 U/ml).
4) Sammeln Sie DCs am 7. Tag der Kultur, resuspendieren Sie mit 2-4 ml RPMI 1640 Komplettkulturmedium, fügen Sie ein gleiches Volumen 14,5% (w/v) Mepanema hinzu und zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur für 20 min bei 1200xg.
5) Sammeln Sie die mittlere Schicht und waschen Sie sie dreimal mit dem vollständigen Kulturmedium RPMI 1640 zur späteren Verwendung.
[Notiz] Der DC ist zu diesem Zeitpunkt ein unreifer BMDC. Wenn Sie ihn weiter reifen lassen möchten, fahren Sie mit Schritt 3 fort.
3.2.3 Volle Reife von BMDC
1) Die in Schritt 2.4 gesammelten BMDCs wurden erneut beschichtet und rekombinantes Maus-GM-CSF (1000 U/ml) und IL-4 (1000 U/ml) sowie LPS (1-10 μg/ml) zum Kultursystem
2) Kultiviert bei 37℃, 5% CO2 2 Tage im Inkubator, um reife BMDCs zu erhalten.
3.3【BMDC-Massenvorbereitungsmethode】-Lutz-Methode
【Hintergrund】
A. Die Lutz-Methode ähnelt der Son-Methode und mit beiden Methoden kann BMDC in großen Mengen hergestellt werden, die Lutz-Methode wird jedoch häufiger verwendet als die Son-Methode.
B. Mit dieser Methode können mehr BMDC erzielt werden, bis zu 1-3 x 108 DC/Maus, und die Reinheit kann 90–95 % erreichen;
C. Die bei dieser Methode verwendete Zytokinkonzentration ist viel niedriger als die der Son-Methode, nur 200 U/mlund sinkt auf 30-100 U/ml vom 8. bis zum 10. Tag der Kultur, wodurch die Reagenzienkosten erheblich gespart werden können;
D. Der größte Unterschied zwischen dieser Methode und der klassischen Inaba-Methode und der Son-Methode besteht darin, dass die Knochenmarkszellen in einer Bakterienkulturschale (Petrischale) statt in einer Zellkulturplatte kultiviert werden. Inaba erklärte, dass es für Makrophagen im Knochenmark nicht leicht ist, an der Wand der Bakterienkulturschale zu haften, wodurch die Entwicklung von Makrophagen gehemmt und die hemmende Wirkung von Makrophagen auf die DC-Reifung vermieden wird. Dies könnte der Hauptgrund sein, warum mit dieser Methode eine große Anzahl von BMDCs bei geringerer Plattendichte erhalten werden kann.
f. Allerdings ist die Kultivierungszeit bei dieser Methode relativ lang und beträgt 10-12 Tage. Einerseits werden dadurch mehr BMDCs gewonnen. Andererseits ist es für die meisten Granulozyten und Lymphozyten schwierig, so lange zu überleben, sodass die Reinheit der schließlich gewonnenen BMDCs verbessert werden kann.
F. Bei dieser Methode wird nur GM-CSF für die Induktionskultur verwendet, und die erhaltenen BMDCs enthalten sowohl unreife als auch reife DCs. Um die Reife weiter zu verbessern, muss LPS oder TNF-α für weitere 1-2 Tage der Induktion verwendet werden, und der Gehalt an reifen DC-Zellen wird 50-70 % erreichen.
【Anbauschritte】
3.3.1 Gewinnung von Knochenmarkszellen von Mäusen
Siehe die entsprechenden Schritte in der Inaba-Methode (modifiziert). Beachten Sie, dass der Hämolyseschritt ausgelassen werden sollte.
3.3.2 Großflächige Herstellung von BMDC
1) Zählen Sie die in Schritt 1 erhaltenen Knochenmarkszellen der Maus und stellen Sie die Zellkonzentration auf 2×10 ein.5/ml mit RPMI 1640-Komplettkulturmedium, das 10 % FBS enthält;
2) Verteilen Sie die Zellen in 100 mm großen Kulturschalen (Petrischalen), 10 ml pro Schale, und fügen Sie rekombinanten Maus-GM-CSF (200 U/ml) und Kultur bei 37 °C, 5 % CO2-Inkubator;
[Notiz] Zum Einsatz kommen hierbei Bakterienkulturschalen und keine Zellkulturplatten.
3) Am 3. Tag fügen Sie 10 ml komplettes Kulturmedium mit 20 ng/ml rekombinanter Maus-GM-CSF zur Kulturschale;
4) Am 6. und 8. Tag wird die Hälfte des Mediums gewechselt, d. h. das alte Kulturmedium wird gesammelt, das Zellpellet wird mit dem vollständigen Kulturmedium mit 20 ng/ml rekombinanter Maus-GM-CSF nach Zentrifugation, und anschließend die Zellsuspension zurück in die Originalschale geben;
5) Am 10. Tag können die Zellen entnommen werden, es handelt sich dabei um BMDCs.
3.3.3 Vollständige Reifung von BMDCs
1) Sammeln Sie die suspendierten Zellen, indem Sie die DCs am 10. Tag der Kultur vorsichtig mit einer Pipette ausblasen, und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 xg bei Raumtemperatur.
2) Das Überstand verwerfen, das Zellpellet mit 10 ml RPMI 1640-Komplettkulturmedium resuspendieren und dann auf einer 100 mm Zellkulturplatte verteilen;
3) Hinzufügen von rekombinantem Maus-GM-CSF (100 U/ml) und TNF-α (500 U/ml) oder rekombinanter Maus-GM-CSF (100 U/ml) und LPS (1 μg/ml);
4) Weiter kultivieren bei 37℃, 5% CO2 Inkubator für 1-2 Tage.
4. Identifizierung von BMDCs
m Morphologische Beobachtung: Die meisten BMDCs wachsen in Kolonien und die Zellen haben mehrere dendritische Vorsprünge, die bei reifen BMDCs deutlicher sichtbar sind.
m Zellphänotypanalyse: Die Expression von CD11c, CD40, CD80, CD86 und MHC-Klasse-II-Molekülen (IA/IE) auf der Oberfläche von DC-Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen. BMDCs exprimieren diese Moleküle stark, und die Expression dieser Moleküle in voll ausgereiften BMDCs wird weiter erhöht sein.
m Gemischte Lymphozytenreaktion (MLR): BMDCs haben eine starke stimulierende Fähigkeit, und je höher die Reife, desto stärker ist die stimulierende Fähigkeit.
5. Wie wählt man einen Reifungsinduktor aus?
LPS, CD40L und TNF-α sind häufig verwendete und wirksame Reifungsinduktoren sowohl für humane als auch für Maus-DC. TNF-α hat von den dreien die schwächste Fähigkeit, die DC-Reifung zu induzieren. LPS und CD40L sind beide starke Induktoren für die vollständige Reifung von DC in vitro. Die von beiden induzierte Reifung von DC ist ähnlich, aber das induzierte Zytokinspektrum ist unterschiedlich. CD40L-induzierte reife BMDC zeigen in vivo die stärkste immunregulatorische Fähigkeit, einschließlich der Erzeugung schützender und therapeutischer Tumorimmunreaktionen. Die Konzentration, die verwendet wird, um die vollständige Reifung von DC mit LPS zu stimulieren, beträgt im Allgemeinen 1-10 μg/mL, aber in der Tat 0,1 μg/mL hat eine sehr starke Wirkung, aber für Versicherungszwecke, 1 Im Allgemeinen wird μg/mL verwendet. Es ist zu beachten, dass CD40L-Moleküle zur TNF-Ligandenfamilie gehören, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie nur nach der Bildung von Trimeren funktionieren können. Daher ist es am besten, rekombinantes CD40L-Trimerprotein zur Stimulierung von DC zu verwenden, was eine gute Wirkung hat. Wenn CD40L-Monomere zur Stimulierung von DC verwendet werden, ist die Reife in den meisten Fällen nicht sehr hoch.
6. Wahl der Trainingsmethode
Tabelle 1.Vergleich dreier gängiger experimenteller Methoden zur Herstellung von BMDC
| Parameter | Klassische BMDC-Kulturmethode - Inaba-Methode | Großtechnische Herstellung von BMDC - Son-Methode | Großtechnische Herstellung von BMDC - Lutz-Methode |
| Anzahl der Zitate in PubMed | 783 | 24 | 663 |
| Knochenmarkhämolyse, Lyse der roten Blutkörperchen | JA | JA | NEIN |
| Knochenmark entfernt zuerst Lymphozyten | JA | NEIN | NEIN |
| Entfernung von Granulozyten während der Kultur | JA | NEIN | NEIN |
| Anfängliches Plattierungsvolumen von Knochenmarkszellen | 1 ml | 15 ml | 10 ml |
| Inkubator | 24-Well-Zellkulturplatten | 6-Well-Zellkulturplatte | 100 mm Bakterienkulturschale |
| Kulturmedium | RPMI 1640+10% FCS | ||
| Konzentration von Maus-GM-CSF | 200-1000 U/ml | Die anfängliche Konzentration beträgt 125-1000 U/ml Am 4. und 7. Tag werden dem Kultursystem ausreichende Mengen GM-CSF und IL-4 hinzugefügt. | Die anfängliche Zugabekonzentration beträgt 200 U/ml.3-100 U/ml nach dem 10. Tag |
| Maus IL-4 | Braucht nicht | Brauchen，Die Konzentration ist die gleiche wie bei GM-CSF | Braucht nicht |
| Flüssigkeitsaustauschmethode | Am 2. und 4. Tag verwerfen Sie 50–75 % des alten Kulturmediums (das Zellen enthält) und ersetzen es durch frisches, vollständiges Kulturmedium, das ausreichend GM-CSF enthält. | / | Am 3. Tag wurde ein gleiches Volumen an vollständigem Kulturmedium mit GM-CSF hinzugefügt. Am 6., 8. und 10. Tag wurde die Hälfte des Mediums ersetzt. Das alte Kulturmedium (mit Zellen) wurde abgesaugt, zentrifugiert, in frischem vollständigem Kulturmedium mit GM-CSF resuspendiert und dann zurückgegeben. |
| Kulturzeit vor der Passagierung (Expansion) | 6 Tage | 7 Tage | 10 Tage |
| Kulturzeit nach der Passage (Reifung) | 2 Tage | Keiner | 1-2 Tage |
| Vollreifeinduktor | TNF-ɑ（250 U/ml） | LPS (1-10) μg/ml) | TNF-ɑ（250 U/ml）oder LPS(1 μg/ml) |
| Zeitpunkt der DC-Zellentnahme | 7-8 Tage | 7-8 Tage | 10-13 Tage |
| DC-Reinheit | Tag 8:60-70 % | Tag 7:85 – 95 % | Tag 10-12:80-90 % |
| DC-Produktion/Maus | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
7. Empfohlene DC-Kulturreagenzien
| Produktname | Katze | Größe |
| 91108ES | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| 90144ES | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| 90621ES | 5 μg/20 μg/50 μg/500 μg | |
| 94016ES | 25 μg/100 μg/500 μg |