Puromycin ist ein Aminoglykosid-Antibiotikum, das von Streptomyces alboniger produziert wird. Es ist ein Analogon des 3'-Endes des Aminoacyl-tRNA-Moleküls und kann an die A-Stelle des Ribosoms binden, sich in die verlängerte Peptidkette einbauen, die Peptidtranslokation am Ribosom stören, einen vorzeitigen Kettenabbruch während der Translation verursachen und so die Proteinsynthese hemmen.
Abbildung 1 Strukturformel von Puromycin (CAS-Nr. 53-79-2)
Das Pac-Gen, das Puromycin-N-Acetyltransferase (pac) kodiert, wurde im Puromycin-produzierenden Bakterium Streptomyces alboniger gefunden und verleiht Resistenz gegen Puromycin. Diese Eigenschaft wird heute häufig genutzt, um stabile transfizierte Zelllinien von Säugetieren zu screenen, die Plasmide mit dem Pac-Gen tragen. Die weit verbreitete Verwendung von Puromycin beim Screening stabiler Zelllinien hängt mit den Eigenschaften lentiviraler Vektoren zusammen, von denen die meisten das Pac-Gen in kommerziellen lentiviralen Vektoren tragen. In bestimmten Fällen kann Puromycin auch zum Screening von E. coli-Stämmen verwendet werden, die mit Plasmiden transformiert wurden, die das Pac-Gen tragen. Puromycin wirkt schnell und kann in niedrigen Konzentrationen schnell zum Zelltod führen. Adhärente Säugetierzellen reagieren empfindlich auf Konzentrationen von 2-5 µg/ml von Puromycin, während Suspensionszellen bereits auf so niedrige Konzentrationen wie 0,5-2 µg/ml Puromycin empfindlich reagieren. Säugetierzellen mit stabiler Resistenz gegen Puromycin können innerhalb einer Woche erzeugt werden.
Screening stabiler Zelllinien
Experimentelles Prinzip
Durch Klonen exogener DNA/shRNA in einen Vektor, der das Pac-Gen trägt, wird der rekombinante Vektor in Wirtszellen transfiziert und in deren Chromosomen integriert, stabil durch Zellteilung übertragen und schließlich mit Puromycin gescreent.
Vorbereitung und Vorversuch
1 Empfohlene Anwendungskonzentrationen
Säugetierzellen: 1–10 μg/ml, die optimale Konzentration muss durch ein Vorexperiment ermittelt werden.
E. coli: Verwenden Sie zum Screening stabil transformierter E. coli, die das Pac-Gen auf LB-Agarmedium tragen, eine Konzentration von 125 μg/ml. Für das Puromycin-Screening stabiler E. coli-Transformanten ist eine genaue pH-Einstellung erforderlich.
2 Auflösungsmethode
Lösen Sie Puromycin in destilliertem Wasser auf, um eine 50 mg/ml-Stammlösung herzustellen, filtern Sie diese mit einem 0,22-μm-Filter steril, teilen Sie die Lösung in Aliquote auf und lagern Sie sie bei –20 °C.
3 Bestimmung der Puromycin-Kill-Kurve (am Beispiel der shRNA-Transfektion oder der lentiviralen Transduktion)
Die effektive Screening-Konzentration von Puromycin hängt vom Zelltyp, Wachstumsstatus, der Zelldichte, dem Zellstoffwechsel und der Position im Zellzyklus ab. Es ist entscheidend, die Mindestkonzentration von Puromycin zu bestimmen, die nicht transfizierte Zellen abtötet. Um eine Abtötungskurve zu erstellen, muss vor dem ersten Experiment ein Puromycin-Gradienten-Screening durchgeführt werden.
- Plattenzellen mit einer Dichte von 5~8×104Zellen/Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen und Kultur über Nacht.
- Screening-Medium vorbereiten: Frisches Medium mit unterschiedlichen Puromycin-Konzentrationen (z. B. 0–15 μg/ml, mindestens 5 Gradienten).
- Durch frisch zubereitetes Screening-Medium ersetzen, mit der Kultivierung fortfahren und das Zellwachstum beobachten. Das frische Screening-Medium alle 2–3 Tage wechseln.
- Beobachten Sie täglich das Überleben der Zellen. Die Mindestkonzentration des Arzneimittels, bei der alle nicht-transfizierten Zellen innerhalb von 4–6 Tagen wirksam abgetötet werden, ist die Mindestkonzentration.
Screening stabiler Transfektanten
- Nach einer lentiviralen Infektion für 48–72 Stunden (70–80 % Konfluenz) werden die Zellen mindestens 48 Stunden lang in einem Medium mit einer geeigneten Konzentration an Puromycin kultiviert. Wenn alle Zellen in der nicht transfizierten Kontrollgruppe mit Puromycin absterben, sind die verbleibenden Zellen in der virusinfizierten Gruppe alle positive Zellen.
【Hinweis】: ① Die Wirkung von Antibiotika ist am ausgeprägtesten, wenn sich die Zellen in einer aktiven Teilungsphase befinden. Die Wirksamkeit von Antibiotika wird erheblich reduziert, wenn die Zellen zu dicht sind. Die Zelldichte sollte 25 % nicht überschreiten. ② Beobachten Sie täglich den Zellwachstumsstatus. Das Puromycin-Screening erfordert mindestens 48 Stunden und die wirksame Konzentration des Puromycin-Screenings hält normalerweise 3 bis 10 Tage an. Je höher die MOI des Virus, desto mehr Kopien von shRNA und Puromycin-Resistenzgen enthält jede Zelle. Beim Puromycin-Screening gilt: Je höher die MOI, desto mehr Pac-Kopien enthalten die Zellen und desto höher ist die Puromycin-Konzentration, die sie vertragen. Passen Sie die Puromycin-Konzentration an, um transfizierte Zellen zu screenen, aber die Puromycin-Konzentration sollte nicht niedriger sein als die minimale wirksame Konzentration der Abtötungskurve.
- Fügen Sie Kulturmedium mit der Mindestkonzentration an Puromycin hinzu, um die Zellen zu vermehren, und fahren Sie mit der Kryokonservierung fort, nachdem die qPCR-Testergebnisse qualifiziert sind.
| ProduktS Name | Katze# | Spezifikation | Aussehen |
| Puromycin Dihydrochlorid CAS: 58-58-2 | 60210ES25 | 25 mg | Weißes bis weißliches Pulver |
| 60210ES60 | 100 mg | ||
| 60210ES72 | 250 mg | ||
| 60210ES76 | 500 mg | ||
| 60210ES80 | 1 G | ||
| Puromycin (Lösung 10 mg/ml) CAS: 58-58-2 | 60209ES10 | 1×1 ml | Lösung (10 mg/ml in H2O) |
| 60209ES50 | 5×1 ml | ||
| 60209ES60 | 10×1 ml | ||
| 60209ES76 | 50×1 ml |
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