- Hintergrund
Die in diesem Bericht zusammengefassten Daten werden von
Die zusammengefassten Daten dienen nur zu Referenzzwecken. Der Benutzer muss die Mykoplasmenmethode anhand seiner eigenen Proben überprüfen, um sicherzustellen, dass die Methode seinen Anforderungen entspricht. Allen Laboren, die dieses Kit verwenden, wird empfohlen, die folgenden Parameter zu überprüfen: Nachweisgrenze, Spezifität und Robustheit.
Validierungsinhalt:
| Leistung | Validierungsparameter | Validierungsergebnisse |
| Nachweisgrenze | Nachweisgrenze für Mykoplasmenstämme | Nachweisgrenze für 10 Arten von Arzneibuch-Mykoplasmen: 10 KBE/ml, jeder 24-mal getestet mit einer Nachweisrate von ≥ 95 %. |
| Spezifität | Beispielmatrixinterferenz | 9 verschiedene Probenmatrizes und DNA-Verdünnungslösungen getestet, kein Mykoplasma nachgewiesen. |
| Kreuzreaktivität | 14 Stämme und 6 häufig in der Biopharmazie verwendete technische Zellen wurden getestet, kein Mykoplasma festgestellt. | |
| Haltbarkeit | Frost-Tau-Stabilität | Hält 20 wiederholten Gefrier-Auftau-Zyklen stand, ohne dass die Leistung des Kits beeinträchtigt wird. |
| Thermische Beschleunigungsstabilität | Unbeeinflusst unter Bedingungen von 37 °C für 14 Tage und 4 °C für 30 Tage. | |
| Gerätekompatibilität | Kompatibel mit ABI7500, ABI QuantStudio™5, Bio-Rad CFX96 und Roche LightCycler®480. | |
| Abdeckung | Abdeckung der Mycoplasma-DNA-Typen | Der Datenbankvergleich mithilfe von Mycoplasma-16S-rRNA-Sequenzen umfasst 183 Arten innerhalb der Klasse Mollicutes. |
- Experimentelle Materialien und Methoden
2.1 MycAwayTM Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit (2G), Anbieter:
2.2 MolPureTM Kit zur magnetischen Probenvorbereitung für Rest-DNA, Anbieter:
2.3 Die Mykoplasmen-Empfindlichkeitsstandards werden von Minerva Biolabs (MB) bezogen, deren Stämme aus der National Collection of Type Cultures (NCTC) stammen. Die Empfindlichkeitsstandards sind inaktivierte Mykoplasmen und werden zur methodischen Überprüfung der Nukleinsäureamplifikationsmethode (qPCR/PCR-Methode) zum Nachweis von Mykoplasmen verwendet. Insgesamt werden 10 Arten von Mykoplasmen bezogen, die die Anforderungen von EP 2.6.7 und JP G3 erfüllen. Die Informationen zu den Standards lauten wie folgt:
| Verkäufer | Katzen-Nr. | NCTC-Nr. | ATCC NEIN. | Materialbezeichnung |
| Minerva Biolabs (MB) | 102-1003 | 10129 | 23838 | 10 KBE™ Empfindlichkeitsstandard Mycoplasma arginini |
| 102-2003 | 10112 | 23714 | 10 KBE™ Empfindlichkeitsstandard Mycoplasma oral | |
| 102-3003 | 10115 | 19610 | 10 KBE™ Empfindlichkeitsstandard Mycoplasma gallisepticum | |
| 102-4003 | 10119 | 15531 | 10 KBE™ Empfindlichkeitsstandard Mycoplasma pneumoniae | |
| 102-5003 | 10124 | 25204 | 10 KBE™ Empfindlichkeitsstandard Mycoplasma synoviae | |
| 102-6003 | 10117 | 19989 | 10 KBE™ Empfindlichkeitsstandard Mycoplasma fermentans | |
| 102-7003 | 10130 | 17981 | 10 KBE™ Empfindlichkeitsstandard Mycoplasma hyorhinis | |
| 102-8003 | 10116 | 23206 | 10 KBE™ Empfindlichkeitsstandard Acholeplasma laylawii | |
| 102-9003 | 10164 | 27556 | 10KBE™ Empfindlichkeitsstandard Spiroplasma citri | |
| 102-11003 | 10113 | 23064 | 10 KBE™ Empfindlichkeitsstandard Mycoplasma salivarium |
2.4 Originaldaten: Die elektronische Version wurde im „Experimentalbericht“ festgehalten. die Unterdatei der übergeordneten Datei 'MycAwayTM Mycoplasma Echtzeit-qPCR-Erkennungskit (2G)‘.
2.5 Methoden: Die für das Experiment verwendeten Materialien und Betriebsmethoden wurden grundsätzlich von
- Qualifikationsinhalte und -ergebnisse
3.1 Nachweisgrenze (LOD)
Die Nukleinsäureextraktion sowie der Nachweis des 10 CFU/mL Mycoplasma-Standardstamms wurden gemäß den Anweisungen für den Standardstamm sowie den Anweisungen für das Extraktions- und Nachweiskit durchgeführt. Insgesamt wurden 24 Analysen für den 10 CFU/mL Mycoplasma-Standardstamm durchgeführt. NCS- (Negative Control Sample) und NTC-Proben (No Template Control) wurden in jedem Experiment gleichzeitig getestet.
Die Ergebnisse zeigten, dass die NCS- und NTC-Ergebnisse zufriedenstellend waren und alle 24 Proben mit 10 KBE/ml positiv waren. Damit wurde die Anforderung von mindestens 23 positiven Ergebnissen bei 24 Tests erfüllt.
| NEIN. | Materialbezeichnung | Konzentration der Bakterienflüssigkeit |
| 1 | Mycoplasma arginini | 10 KBE/ml |
| 2 | Mycoplasma oral | 10 KBE/ml |
| 3 | Mycoplasma gallisepticum | 10 KBE/ml |
| 4 | Mycoplasma pneumoniae | 10 KBE/ml |
| 5 | Mycoplasma synoviae | 10 KBE/ml |
| 6 | Mycoplasma fermentans | 10 KBE/ml |
| 7 | Mycoplasma hyorhinis | 10 KBE/ml |
| 8 | Achillesferse Abonnieren | 10 KBE/ml |
| 9 | Spiroplasma citri | 10 KBE/ml |
| 10 | Mycoplasma salivarium | 10 KBE/ml |
Tabelle 1 Informationen zu validierten Stämmen
| 10 KBE/ml | Versuch 1 | Versuch 2 | Versuch 3 |
| Erkennungsrate | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| Gesamt | 24/24 | ||
Tabelle 2 Ergebnisse der Nachweisgrenze
3.2 Spezifität
3.2.1 Mykoplasmen-Testbereich
Die Primer-Sondensequenzen im Kit wurden mit dem 16S rRNA-Genom in der Datenbank verglichen. Durch bioinformatische Analyse wurde festgestellt, dass MycAwayTM Das Mycoplasma qPCR Detection Kit (Sondenmethode) von NextSense Biologicals kann mindestens 183 Arten von Zooxanthellen abdecken, darunter 120 Mycoplasma, 9 Ureaplasma, 33 Spiroplasma und 7 Cholestrongyla usw.
3.2.2 Probenmatrixinterferenz
9 Substrate (Dulbeccos MEM, Hams F-10-Medium, M-199-Medium, Hams F-12K Kaighns, RPMI-1640-Medium, McCoys 5A, Hams F-12K Kaighns +1,0 mM/l Glutamin, L-15 LEIBOVITZ MEDTA +2.05 mM L-Glutamin, DMEM-Standardmedium mit niedrigem Glukosegehalt) werden als Proben verwendet, um die Interferenz der Probenmatrix zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigten, dass das Medium keine Interferenzen mit den Kit-Reagenzien aufweist.
3.2.3 Nachweisbereich von Flexibakterien
Extraktion und Nachweis von inaktiviertem Mykoplasma (Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hyorhinis, Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma citri, Mycoplasma salivarium) bei 10 KBE/ml sind zusammen mit NCS- und NTC-Probentests erforderlich.
Die Ergebnisse zeigten, dass NCS und NTC nicht nachgewiesen wurden und die Ergebnisse negativ waren; alle 10 Mykoplasmenarten wurden nachgewiesen und die Ergebnisse waren positiv.
3.2.4 Kreuzreaktion
Für 14 nicht-flexibakterielle Stämme, darunter Clostridium (Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum), Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus), Streptococcus (Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae), eine Reihe anderer häufiger Bacillus-Coccus-Pilz-Mikroorganismen (Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Micrococcus garciniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonalbacterium leucocephala, Salmonella enterica enteritidis subsp. enterica, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis und Bacillus sp. Bacillus cereus, Bacillus cereus) und sechs gentechnisch veränderte Zellen (HEK293, 293T, Vero, CHO, E.coli, SF9) wurden für den Mykoplasmennachweis mit dem MolPureTM Magnetperlenmethode für Rest-DNA-Probenvorverarbeitungskit (Flaschen) und MycAwayTM Mycoplasma qPCR Detection Kit (Sondenmethode) (2G), und jedes Experiment wurde gleichzeitig mit der PCS-, NCS- und NTC-Probenuntersuchung durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigten, dass die PCS-, NCS- und NTC-Ergebnisse zufriedenstellend waren; die Testproben waren negativ und es trat keine Kreuzreaktivität auf.
3.3 Robustheit
3.3.1 Frost-Tau-Stabilität
Das Mycoplasma-Testkit wurde Gefrier-Auftau-Experimenten unter den Bedingungen von -25 °C bis -15 °C unterzogen und die Ergebnisse zeigten, dass das Kit 20-maligem Einfrieren und Auftauen standhielt, ohne dass seine Leistung beeinträchtigt wurde.
3.3.2 Beschleunigte Stabilität
Das Mycoplasma-Erkennungskit wurde 14 Tage lang bei 37 °C bzw. 30 Tage lang bei 4 °C hitzebeschleunigt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Produktleistung nicht beeinträchtigt wurde.
3.3.3 Anwendbarkeit des Instruments
Für das Mykoplasmen-Erkennungskit wurden unterschiedliche Konzentrationen der positiven Kontrolle und der Mycoplasma pneumoniae-DNA im Kit als zu testende Proben verwendet, und die Experimente wurden mit vier verschiedenen Marken und Modellen durchgeführt, nämlich Thermo Scientific ABI7500, Thermo Scientific ABI Q5, Shanghai Hongshi SLAN-96S und Roche LightCycler®480.Die Experimente wurden auf qPCR-Instrumenten von vier verschiedenen Marken und Modellen durchgeführt, Shanghai Hongshi SLAN-96S und Roche LightCycler®480.
Die Ergebnisse zeigten, dass die zu testenden Proben auf qPCR-Instrumenten verschiedener Herstellermodelle erkannt wurden, die Ergebnisse der Negativkontrolle qualifiziert waren und die Leistung des Kits nicht beeinträchtigt wurde.
- 4.Referenz
4.1 Mycoplasma-Untersuchungsmethode <3301>. Chinesisches Arzneibuch, Teil III [S]. Beijing: China Science and Technology Press, 2020: 542-543.
4.2 Richtlinien zur Validierung analytischer Methoden <9101>. Chinesisches Arzneibuch, Teil III [S]. Beijing: China Science and Technology Press, 2020: 682.
4.3 Richtlinien zur Validierung alternativer Methoden zur mikrobiologischen Prüfung von Arzneimitteln <9201>. Chinesisches Arzneibuch, Teil III [S]. Beijing: China Science and Technology Press, 2020: 684.
4.4 Mykoplasmen. Europäisches Arzneibuch[S]. 10. Auflage, 2020: Abschnitt 2.6.7, 194-199.
4.5 Mykoplasmen-Tests für Zellsubstrate, die zur Herstellung biotechnologischer/biologischer Produkte verwendet werden <G3-14-170>. Das japanische Arzneibuch[S]. 18. Ausgabe, 2021: 2678-2682.
4.6 Erica J. Fratz-Berilla, Phillip Angart, Ryan J. Graham, et al. Auswirkungen auf die Produktqualitätsmerkmale von monoklonalen Antikörpern, die in CHO-Zellbioreaktorkulturen während absichtlicher Mykoplasmenkontaminationen produziert werden. Biotechnologie und Bioengineering. 2020;117(9): 2802-2815.
4.7 Dmitriy V. Volokhov, Laurie J Graham, Kurt A Brorson, Vladimir E Chizhikov. Mykoplasmen-Tests von Zellsubstraten und Biologika: Überblick über alternative nicht-mikrobiologische Techniken. Mol Cell Probes. 2011 Apr-Jun;25(2-3):69-77.
4.8 AL Ingebritson, CP Gibbs, C. Tong, GB Srinivas. Eine PCR-Nachweismethode zum Testen der Mycoplasma-Kontamination von Veterinärimpfstoffen und biologischen Produkten. Lett in Applied Microbiology. 2015 Feb;60(2):174-180.
Bestellinformationen
| Beschreibung | Teilenummer |
| 18461ES | |
| MycAway™ Mycoplasma qPCR-Nachweiskit (2G) | 40619ES |