Überblick
Rest-DNA der Wirtszelle ist eine prozessbedingte Verunreinigung bei der Herstellung von Biologika, die nicht nur die Wirksamkeit der Biologika verringert, sondern auch Sicherheitsbedenken wie Infektiosität oder Tumorbildung hervorrufen kann. Daher haben Aufsichtsbehörden in verschiedenen Ländern Grenzwerte für die Menge an Rest-DNA in Biologika festgelegt.
Die aktuellen Leitlinien der WHO und FDA empfehlen einen DNA-Rückstand von nicht mehr als 10 ng/Dosis in Fertigprodukten. Die FDA gibt außerdem an, dass der DNA-Rückstand in der Wirtszell-DNA von Biologika nicht mehr als 100 pg/Dosis betragen sollte. Die Allgemeinen Grundsätze des Europäischen Arzneibuchs legen fest, dass die meisten Grenzwerte für DNA-Rückstände in biologischen Produkten nicht mehr als 10 ng/Dosis betragen sollten. Die Grenzwerte für DNA-Rückstände einzelner Impfstoffe sind jedoch strenger. Beispielsweise sollte der DNA-Rückstand im inaktivierten Impfstoff gegen Hepatitis A nicht mehr als 100 pg/Dosis betragen und der DNA-Rückstand im Impfstoff gegen Hepatitis B nicht mehr als 10 pg/Dosis. Teil III der Ausgabe 2020 des Chinesischen Arzneibuchs legt fest, dass der DNA-Rückstand in auf einer zellulären Matrix hergestellten biologischen Präparaten 100 pg/Dosis nicht überschreiten darf und der DNA-Rückstand in auf einer bakteriellen oder Pilzmatrix hergestellten Impfstoffen 10 ng/Dosis nicht überschreiten darf.
Darüber hinaus enthalten nationale Arzneibücher auch Leitlinienempfehlungen für die Methoden zur Bestimmung exogener DNA-Rückstände. Die Ausgabe 2017 der US-amerikanischen Allgemeinen Bestimmungen USP40-NF35 1130 beschreibt drei Methoden zur Bestimmung exogener DNA-Rückstände: DNA-Sondenhybridisierung, Schwellenwertmethode und quantitative Echtzeit-PCR-Methode. Das Europäische Arzneibuch schlägt quantitative Echtzeit-PCR und immunenzymatische Methoden vor, zwei empfindliche Analysemethoden zur Quantifizierung von DNA-Rückständen in Wirtszellen. Die drei Allgemeinen Bestimmungen 3407 der chinesischen Arzneibuchversion 2020 legen außerdem fest, dass die Methoden zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen DNA-Sondenhybridisierung, Fluoreszenzfärbung und quantitative PCR sind.
Unter ihnen weist die qPCR-Methode eine sehr hohe Sensitivität, Sequenzspezifität und Genauigkeit auf, sodass sie der biopharmazeutischen Industrie bei der Prozessforschung und Qualitätskontrolle von Fertigprodukten ein zuverlässiges Nachweismittel bieten kann und mittlerweile für alle Hersteller biologischer Produkte zur bevorzugten Nachweismethode geworden ist.
Yeasen Biotechnologie Kits zur Erkennung von DNA-Resten
Basierend auf dem Prinzip der Fluoreszenzsonden-qPCR hat
Besonderheit
Hohe Empfindlichkeit: entwickelt basierend auf der qPCR-Methode mit Fluoreszenzsonden mit einer LLOD von nur 0.0,05 fg/µL;
Hohe Genauigkeit: Probenwiederfindungen durch Spikes im Bereich von 70 % bis 130 %;
Hohe Spezifität: keine Kreuzreaktivität mit irrelevanter DNA, wodurch falsch-positive Ergebnisse bei der Erkennung reduziert werden;
Einhaltung von Vorschriften: vollständig validiert gemäß Chp, USP, ICHQ2(R1) und anderen Anforderungen, Leistung gemäß chinesischen und ausländischen regulatorischen Standards;
Mitarbeit bei der Wirtschaftsprüfung: Die Produktherstellung entspricht den Qualitätssystemstandards ISO13485 und verfügt über einwandfreie Prüfdokumente.
Garantierte Qualität: Die Rohstoffe der Kits werden alle unabhängig voneinander entwickelt und der qPCR-Mix und andere Enzymprodukte werden in einer ultrareinen Enzymfabrik hergestellt.
Anwendung
Antikörper-MedikamenteNachweis von Restverunreinigungen in WirtszellenImpfstoffeNachweis von Restverunreinigungen in Wirtszellen
Rekombinante ProteinmedikamenteNachweis von Restverunreinigungen in Wirtszellen
Spezifikation
| Test- und Validierungsprogramm | Referenznormen oder -anforderungen | NAnmerkung | |
| 1. Kit-Standards (Referenzstandards) | Benchmarking anhand nationaler Standards oder vorbereitete Standards |
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| 2. Mim Ohr Range | Umfang der Standardkurve | Siehe Handbuch oder tatsächliche Situation (z. B. 30 fg/µl bis 300 pg/µl) |
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| R2 | ≥0,98 (Ps | Anforderungen an HCD im chinesischen Arzneibuch 2020 Ausgabe 3407 Allgemeine Bestimmungen | |
| Neigung | -3,1 bis -3,8 (Ps | Anforderungen an HCD im chinesischen Arzneibuch 2020 Ausgabe 3407 Allgemeine Bestimmungen | |
| Verstärkungseffizienz | 90 % ~ 110 % (Ps) Entsprechende Steigung -3.1–3.6, Anforderungen innerhalb der Branche） |
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| 3. AGenauigkeit | Abweichung vom nationalen Standard DNA | ＜15 % |
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| Wiederfindungsrate der Probe durch Aufstockung | 50 % ~ 150 % (Anforderungen innerhalb der Branche 70 – 130 %） | Anforderungen an HCD im chinesischen Arzneibuch 2020 Ausgabe 3407 Allgemeine Bestimmungen | |
| 4. PEntscheidung | Wiederholbar | Lebenslauf＜15% |
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| Mittlere Präzision | Lebenslauf＜15% |
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| 5. SSpezialität | Keine Interferenz mit exogener DNA |
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| 6. MGrenze der Quantifizierung | fg/µL-Wert |
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| 7. STischbarkeit | Wiederholtes Einfrieren und Auftauen | 10 mal |
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| Beschleunigungsstabilität | 2~8℃ 30 Tage, 37℃ 14 Tage |
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| Gültigkeitsdauer | -20°C Lagerung für 2 Jahre |
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Zahlen
Hohe Empfindlichkeit: LLOQ so niedrig wie 0,3 fg/µL, LLOD so niedrig wie 0,05 fg/µL.
1.Der lineare Bereich des CHO Host Cell Residual DNA Detection Kit (3G) betrug 3fg/μL~300pg/μL, R2=1, die Amplifikationseffizienz betrug 99,29 % und der CV des Nachweiswertes jeder Konzentration betrug < 15 %.
Abbildung 1. CHO-DNA (3G)-Kalibrierungsdiagramm (links) und lineare Abbildung der Amplifikationskurve (rechts)
2. Nachweis von CHO-DNA (3G) am niedrigsten Konzentrationspunkt des standardisierten Lieds bei Konzentrationen von 3 fg/uL und darunter, 10 Replikate pro Konzentration. Die Ergebnisse zeigten, dass bei Konzentrationen von 0,3 fg/uL und darüber der CV <20 % war, d. h. die Quantifizierungsgrenze des CHO Host Cell DNA Residue Assay Kit (3G) betrug 0,3 fg/uL.
Abbildung 3. 0,05fg/μL CHO DNA (3G) qPCR-Testergebnisse
Hohe Spezifität: keine Kreuzreaktivität mit anderer Wirtszell-DNA.
Bei der Bewertung der Interferenz genomischer DNA von Mausarten mit hoher Affinität zu CHO-DNA (3G) sowie genomischer DNA von Zellen, die üblicherweise bei der Herstellung von Biologika verwendet werden, mit dem CHO-DNA-Nachweisreagenz überlappten sich die Amplifikationskurven der Interferenzgruppe und der Kontrollgruppe, und es wurde keine Interferenz beobachtet (die folgenden Grafiken zeigen in der angegebenen Reihenfolge die Interferenzdaten genomischer Maus-, HEK293- und E. coli-DNA mit dem CHO-DNA-Nachweisreagenz).
Abb. 4.Ergebnisse von Interferenzexperimenten mit dem CHO DNA (3G) Kit
Produktinformationen
| Kategorisierung | Artikelnr | Produktname | Spezifikation |
| Probenvorbehandlung | 18461ES | 25T/100T | |
| 18467ES | MolPure® Mag48 Probenvorbereitungskit FN | 3×16Z/6×16Z | |
| Instrument zur Nukleinsäureextraktion | 80511ES | 48-Kanal-Automatischer Nukleinsäureextraktor | 48 Flussmittel |
| Nachweis von DNA-Resten | 41307ES | 50T/100T | |
| 41308ES | 50T/100T | ||
| 41310ES | SV40LTA&E1A DNA-Rückstandserkennungskit | 50T/100T | |
| 41317ES | Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen von Hansenula polymorpha | 50T/100T | |
| 41319ES | MDCK-Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen | 50T/100T | |
| 41323ES | Kit zur Erkennung von Plasmid-DNA-Rückständen | 50T/100T | |
| 41324ES | Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen von S. cerevisiae | 50T/100T | |
| 41325ES | Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in menschlichen Wirtszellen | 50T/100T | |
| 41328ES | Pichia pastoris Wirtszell-DNA-Rückstands-Nachweiskit | 50T/100T | |
| 41330ES | Kit zur Erkennung von Sf9- und Baculovirus-DNA-Rückständen | 50T/100T | |
| 41331ES | HEK293-Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen (3G) | 50T/100T | |
| 41332ES | 50T/100T |