CHO Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen (3G)
Qualifikationszusammenfassung (Kat.-Nr.: 41332ES60)
- Hintergrund
Die in diesem Bericht zusammengefassten Daten werden von
- Experimentelle Materialien und Methoden
2.1 CHO Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen (3G), Anbieter:
2.2 MolPure Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit, Anbieter:
2.3 Originaldaten: Die elektronische Version wurde im „Experimentbericht“ aufgezeichnet. die Unterdatei der übergeordneten Datei CHO Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen (3G).
2.4 Methoden: Die für das Experiment verwendeten Materialien und Betriebsmethoden wurden grundsätzlich von
- Qualifikationsinhalte und -ergebnisse
3.1 Erfassungsbereich
Der lineare Bereich des Kits betrug 3 fg/μL~300 pg/μL mit R2=1, und die Amplifikationseffizienz betrug 99,09 % mit CV < 15 % für jeden Konzentrationstest.
Abbildung 1 CHO DNA (3G) qPCR Standardkurve
3.2 Richtigkeit
3.2.1 RErholung
3.2.1.1 Experiment zur Wiederfindung von Blindproben durch Aufstockung
Proben von CHO DNA-Standards in hohen und niedrigen Konzentrationen: 30 pg/µL, 300 fg/μL bzw. 3 fg/μL wurden hergestellt und nach der Extraktion mit dem Magnetic Bead Method for Residual DNA Sample Pre-treatment Kit (3 Für jede Probe wurden Extraktionsreplikate und für jede Extraktion drei Testreplikate durchgeführt und die Probenwiederfindungen und CVs wurden analysiert.
Bei unterschiedlichen Konzentrationen der DNA-Proben lagen die Wiederfindungsraten zwischen 70 % und 130 % und die CVs lagen alle unter 20 %.
| Probentyp | Theoretische Konzentration | Extrahieren Sie 1 Mittelwert | Extrahieren Sie 2 Mittelwerte | Extrahieren Sie 3 Mittelwerte | Durchschnittliche Konzentration | Lebenslauf | Erholung |
| Leere Probe | / | / | / |
| / | / | / |
| Wiederfindungsprobe 1 | 30 pg/µl | 27.07 | 27,51 | 28,27 | 27,62 | 2,20 % | 92,06 % |
| Wiederfindungsprobe 2 | 300 fg/µL | 285,53 | 301,25 | 295,71 | 294,16 | 2,71 % | 98,05 % |
| Wiederfindungsprobe 3 | 3 fg/µL | 3,50 | 3.54 | 3.31 | 3,45 | 3,56 % | 115,00 % |
Tabelle 1: Wiederfindung durch Aufstockung der Blindprobe
3.2.1.2 Simuliertes Experiment zur Probenrückgewinnung durch Spiking
Proben der gleichen Konzentration (300 fg/μL CHO-DNA) wurden mit 5 verschiedenen Hintergrundlösungen (hoher Proteingehalt, hoher Nukleinsäuregehalt, hoher und niedriger pH-Wert, hoher Salzgehalt) extrahiert (für jede Probe wurden 3 Extraktionsreplikate und für jede Extraktion 3 Testreplikate durchgeführt) und die Probenwiederfindungen und CVs wurden analysiert.
Die DNA-Probenwiederfindungen für verschiedene Hintergrundlösungen lagen zwischen 70 % und 130 %, wobei alle CVs unter 20 % lagen.
| Probentyp | Theoretische Konzentration | Extrahieren Sie 1 Mittelwert | Extrahieren Sie 2 Mittelwerte | Extrahieren Sie 3 Mittelwerte | Durchschnittliche Konzentration | Lebenslauf | Erholung |
| Einfaches Beispiel | / | / | / |
| / | / | / |
| Hoher Proteingehalt | 300 fg/μL | 302,29 | 332,86 | 342,76 | 325,97 | 6,47 % | 108,66 % |
| Hoher Kernsäuregehalt | 284,47 | 290,66 | 308,76 | 294,63 | 4,28 % | 98,21 % | |
| Hoher Salzgehalt | 272,96 | 286,25 | 312,91 | 290,71 | 7,00 % | 96.90 % | |
| Hoher pH-Wert | 296,04 | 320,58 | 324,56 | 313,72 | 4,92 % | 104,57 % | |
| Niedriger pH-Wert | 314,77 | 327,89 | 340,26 | 327,64 | 3,89 % | 109,21 % |
Tabelle 2 Grundlegende Probenwiederfindung durch Spiken
3.3 Präzision
3.3.1 Wiederholbarkeit
Wiederholen Sie den Test 10-mal für CHO-DNA-Standards bei einer Konzentration von 3 fg/μL mit einem CV <15 %.
| Wiederholungen | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Bedeuten | CV% |
| Nachweiswert (fg/µL) | 3.13 | 3.26 | 2,89 | 3.16 | 2,95 | 2,87 | 2,88 | 2,75 | 2,87 | 3.15 | 2,99 | 5,65 % |
Tabelle 3: Wiederholbarkeitsergebnisse
3.3.2 Mittlere Präzision
Drei Experimentatoren testeten unabhängig voneinander CHO-DNA-Standardproben bei hohen und niedrigen Konzentrationen: 300 pg/µl, 3 pg/µl und 3 fg/µl. Für jede Konzentration wurden drei Replikate durchgeführt und die CVs aller neun erhaltenen Daten lagen bei <15 %.
| Erfahrung |
Tatsächliche Konzentration Theoretische Konzentration | CHO-DNA (3G) | ||
| 300 pg/µL | 3 pg/µL | 3 fg/µL | ||
| Erfahrung 1 | Bestimmung 1 | 302,63 | 2,97 | 3.40 |
| Bestimmung 2 | 294,54 | 3.01 | 3.14 | |
| Bestimmung 3 | 287,67 | 2,99 | 3.01 | |
| Exp2 | Bestimmung 4 | 292,27 | 2,92 | 3.47 |
| Bestimmung 5 | 299,61 | 2,90 | 2,82 | |
| Bestimmung 6 | 305,73 | 2,93 | 2,90 | |
| Erfahrung 3 | Bestimmung 7 | 301.06 | 3.17 | 3.15 |
| Bestimmung 8 | 299,17 | 3,00 | 3.21 | |
| Bestimmung 9 | 290,66 | 2,90 | 3.05 | |
| / | Bedeuten | 297,04 | 2,98 | 3.13 |
| / | CV% | 2.03 | 2,80 | 6,85 |
Tabelle 4 Ergebnisse zur mittleren Präzision
3.4 Spezifität
Die Interferenz zellulärer genomischer DNA, die üblicherweise bei der Herstellung von Biologika verwendet wird, wurde auf Interferenzen mit CHO-DNA-Nachweisreagenzien untersucht. Die Interferenzgruppe überlappte sich mit der Kontrollgruppe und es wurden keine Interferenzen beobachtet (die folgende Abbildung zeigt in der Reihenfolge die Interferenzdaten genomischer DNAs von Maus, MDCK, HEK293 und E. coli mit CHO-DNA-Nachweisreagenzien).
Abbildung 2 Ergebnisse des Interferenzexperiments
3.5 Bestimmungsgrenze
CHO-DNA wurde bei 3 fg/μL, 1 fg/μL, 0,5 fg/μL, 0,3 fg/uL und 0,1 fg/μL nachgewiesen, mit 10 Replikaten für jede Konzentration. Die Ergebnisse zeigten, dass der CV bei Konzentrationen von 0,3 fg/μL und mehr <20 % betrug. Das heißt, die Quantifizierungsgrenze des CHO-Wirtszell-DNA-Rückstandsnachweiskits (3G) betrug 0,3 fg/μL.
|
Wiederholungen Prüfling | CHO-DNA (3G) (fg/μL) | |
| Menge | Neuberechnungsverhältnis % | |
| 1 | 0,28 | 93,33 % |
| 2 | 0,26 | 86,67 % |
| 3 | 0,32 | 106,67 % |
| 4 | 0,30 | 100,00 % |
| 5 | 0,33 | 110,00 % |
| 6 | 0,23 | 76,67 % |
| 7 | 0,29 | 96,67 % |
| 8 | 0,37 | 123,33 % |
| 9 | 0,31 | 103.33 % |
| 10 | 0,28 | 93,33 % |
| Bedeuten | 0,30 | / |
| CV% | 13,09 % | / |
Abbildung 3. CHO DNA (3G) qPCR Testergebnis
3.6 Nachweisgrenze
CHO-DNA wurde bei 0,3 fg/μl, 0,1 fg/μl, 0,05 fg/μl und 0,01 fg/μl nachgewiesen, mit 20 Replikaten für jede Konzentration. Die Ergebnisse zeigten, dass die Nachweisrate ≥19 (d. h. Nachweisrate ≥95 %) in 20 Replikatvertiefungen bei Konzentrationen von 0,05 fg/μl und mehr betrug. Das heißt, die Nachweisgrenze des CHO-Wirtszell-DNA-Rückstandsnachweiskits (3G) betrug 0,05 fg/μl.
Abbildung 4. CHO DNA (3G) qPCR-Testergebnis
3.7 Robustheit
Dieses Kit wurde getestet und ist für die folgenden Instrumente geeignet (jedoch nicht darauf beschränkt):
| Verkäufer | Instrumentenmodelle | Verstärkungseffizienz | R2 | Bestimmungsgrenze | Lebenslauf | Nachweisgrenze | Erkennungsrate |
| Thermo | ABI 7500 | 99,69 % | 1 | 0,3 fg/µL | 12,40 % | 0,05 fg/µL | 95,65 % |
| Thermo | ABI QuantStudio5 | 99,26 % | 1 | 0,3 fg/µL | 15,30 % | 0,05 fg/µL | 100,00 % |
| Roche | LichtCycler480 | 2,05 % | 0,978 | 0,3 fg/µL | / | 0,05 fg/µL | / |
| Shanghai Hongshi | SLAN | 101,14 % | 0,999 | 0,3 fg/µL | 14,41 % | 0,05 fg/µL | 95,65 % |
Tabelle 5 Ergebnisse des Geräteeignungstests
3.8 Stabilität
3.8.1 Frost-Tau-Stabilität
Das CHO Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G) wurde durch 10-maliges Einfrieren und Auftauen getestet. Die Leistung des Kits wurde nicht beeinträchtigt.
|
Testindikatoren Gefrier-Tau-Zeiten | Parameter | T0-Zeit | 10 mal einfrieren und auftauen |
| Standardkurvenparameter | Verstärkungseffizienz | 95,70 % | 98,62 % |
| R2 | 1 | 1 | |
| Bestimmungsgrenze (0,3 fg/μL) | Lebenslauf | 15,31 % | 17,16 % |
| Nachweisgrenze (0,05 fg/μL) | Erkennungsrate | 95,65 % | 100 % |
Tabelle 6 Ergebnisanalyse der Frost-Tau-Stabilität
3.7.2 Beschleunigte Stabilität
Das CHO Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G) wurde 30 Tage lang bei 2–8 °C bzw. 14 Tage lang bei 37 °C gelagert. Die Leistung des Kits wurde dadurch nicht beeinträchtigt.
|
Testindikatoren Beschleunigung Temperatur & Zeit | Parameter | Versuch 1 | Versuch 2 | ||
| T0-Zeit | 2~8℃ 30 Tage | T0-Zeit | 37℃ 14 Tage | ||
| Standardkurvenparameter | Verstärkungseffizienz | 100,53 % | 102,61 % | 101,76 % | 101,84 % |
| R2 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Bestimmungsgrenze (0,3 fg/μL) | Lebenslauf | 17,16 % | 12,63 % | 16,27 % | 12,49 |
| Nachweisgrenze (0,05 fg/μL) | Erkennungsrate | 95,65 % | 100 % | 95,57 % | 100 % |
Tabelle 7 Beschleunigte Stabilitätsergebnisanalyse
3.9 Leerzeichengrenze
3.9.1 Keine Vorlagenkontrolle (NTC)
Bei der No-Template-Kontrolle (NTC) handelte es sich um die DNA-Verdünnung mit 96 Wiederholungen zur Durchführung des quantitativen qPCR-Tests. Alle CT-Werte über den 96 getesteten Replikationsvertiefungen lagen bei >40.
Abbildung 5 Ergebnisse des NTC-Experiments
3.9.2 Negative Extraktionskontrollprobe (NCS)
Bei der negativen Extraktionskontrollprobe (NCS) handelte es sich um die DNA-Verdünnung. Sie wurde zunächst durch eine Probenvorbehandlung extrahiert und anschließend eine qPCR durchgeführt. Alle CT-Werte über den 48 getesteten Replikationsvertiefungen lagen bei >40.
Abbildung 6 NCS Versuchsergebnisse
- 4.Referenz
4.1 Chinesische Arzneibuchkommission (ChPC). Arzneibuch der Volksrepublik China (Band Ⅲ) [S]. Beijing: China Medical Science and Technology Press, S. 542–543, 2020.
4.2 NMPA, 2007: Allgemeine Grundsätze für die technische Überprüfung der Validierung analytischer Methoden zur Qualitätskontrolle biologischer Produkte.
4.3 ICH (2022) „Analytische Methodenvalidierung Q2“, Entwurfsversion.
Bestellinformationen
| Beschreibung | Teilenummer |
| 41332ES | |
| HEK293-Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen (3G) | 41331ES |
| Vero Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen (2G) | 41307ES |
| Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen von E.coli (2G) | 41308ES |
| 18461ES | |
| MycAway™ Mycoplasma qPCR-Nachweiskit (2G) | 40619ES |