HEK293 Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen (3G)
Qualifikationsübersicht (Kat.-Nr.: 41331ES60)
- Hintergrund
Die in diesem Bericht zusammengefassten Daten wurden von
- Experimentelle Materialien und Methoden
2.1 HEK293 Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen (3G), Anbieter:
2.2 MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit, Anbieter:
2.3 Originaldaten: Die elektronische Version wurde im „Experimentalbericht“ festgehalten die Unterdatei der übergeordneten Datei 'HEK293 Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen (3G)‘.
2.4 Methoden: Die für das Experiment verwendeten Materialien und Betriebsmethoden wurden grundsätzlich von
- Qualifikationsinhalte und -ergebnisse
3.1 Erfassungsbereich
Der lineare Bereich des Kits betrug 30 fg/μL~300 pg/μL mit R2≥0,998, und die Amplifikationseffizienz lag bei 90 %–110 % mit CV < 15 % für jeden Konzentrationstest.
Abbildung 1 HEK293 DNA (3G) qPCR-Standardkurve
3.2 Richtigkeit
3.2.1 RErholung
3.2.1.1 Experiment zur Wiederfindung von Blindproben durch Aufstockung
Proben von HEK293 DNA-Standards in hohen und niedrigen Konzentrationen: 300 pg/µl, 3 pg/µl und 30 fg/µl wurden jeweils hergestellt und nach der Extraktion unter Verwendung des Magnetic Bead Method for Residual DNA Sample Pre-treatment Kit untersucht (für jede Probe wurden 2 Extraktionsreplikate und für jede Extraktion 3 Untersuchungsreplikate durchgeführt) und die Probenwiederfindungen und CVs wurden analysiert.
Bei unterschiedlichen Konzentrationen der DNA-Proben lagen die Wiederfindungsraten zwischen 70 % und 130 % und die CVs lagen alle unter 20 %.
| Probentyp | Theoretische Konzentration | Extrahieren Sie 1 Mittelwert | Extrahieren Sie 2 Mittelwerte | Durchschnittliche Konzentration | Lebenslauf | Erholung |
| Leere Probe | / | / | / | / | / | / |
| Wiederfindungsprobe 1 | 300 pg/µL | 306,81 pg/µL | 279,57 pg/µL | 293,82 pg/µL | 6,56 % | 97,94 % |
| Wiederfindungsprobe 2 | 3 pg/µL | 3.11 pg/µL | 2,99 pg/µL | 3.09 pg/µL | 2,75 % | 103,00 % |
| Wiederfindungsprobe 3 | 30 fg/µL | 31.02 fg/µL | 30,63 fg/µL | 30,83 fg/µL | 0,89 % | 102,77 % |
Tabelle 1: Wiederfindung durch Aufstockung der Blindprobe
3.2.1.2 Simuliertes Experiment zur Probenrückgewinnung durch Spiking
Proben der gleichen Konzentration (3 pg/µL HEK293-DNA) wurden mit 5 verschiedenen Hintergrundlösungen (hoher Proteingehalt, hoher Nukleinsäuregehalt, hoher und niedriger pH-Wert, hoher Salzgehalt) extrahiert (für jede Probe wurden 2 Extraktionsreplikate und für jede Extraktion 3 Testreplikate durchgeführt) und die Probenwiederfindungen und CVs wurden analysiert.
Die DNA-Probenwiederfindungen für verschiedene Hintergrundlösungen lagen zwischen 70 % und 130 %, wobei alle CVs unter 20 % lagen.
| Probentyp | Theoretische Konzentration | Extrahieren Sie 1 Mittelwert | Extrahieren Sie 2 Mittelwerte | Durchschnittliche Konzentration | Lebenslauf | Erholung |
| Einfaches Beispiel | / | / | / | / | / | / |
| Hoher Proteingehalt | 3 pg/µL | 2,65 | 2,80 | 2,73 | 3,80 % | 90,87 % |
| Hoher Kernsäuregehalt | 2,82 | 2,97 | 2,90 | 3,71 % | 96,58 % | |
| Hoher Salzgehalt | 2,88 | 2,70 | 2,79 | 4,47 % | 92,89 % | |
| Hoher pH-Wert | 2,81 | 2,93 | 2,87 | 2,98 % | 95,71 % | |
| Niedriger pH-Wert | 2.76 | 2,79 | 2,77 | 0,99 % | 92,48 % |
Tabelle 2 Grundlegende Probenwiederfindung durch Spiken
3.3 Präzision
3.3.1 Wiederholbarkeit
Wiederholen Sie den Test 10-mal für HEK293-DNA-Standards bei einer Konzentration von 30 fg/μL mit einem CV <15 %.
| Wiederholungen | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Bedeuten | CV% |
| Nachweiswert (fg/µL) | 29,51 | 30.02 | 30.13 | 30.16 | 27,99 | 31.01 | 31.05 | 30,95 | 31.02 | 29,86 | 30.17 | 3,15 % |
Tabelle 3: Wiederholbarkeitsergebnisse
3.3.2 Mittlere Präzision
Drei Experimentatoren testeten unabhängig voneinander HEK293-DNA-Standardproben bei hohen und niedrigen Konzentrationen: 300 pg/μl, 3 pg/μl und 30 fg/μl. Für jede Konzentration wurden drei Replikate durchgeführt und die CVs aller neun erhaltenen Daten lagen bei <15 %.
| Erfahrung |
Tatsächliche Konzentration Theoretische Konzentration | HEK293 DNA (3G) | ||
| 300 pg/µL | 3 pg/µL | 30 fg/µL | ||
| Erfahrung 1 | Bestimmung 1 | 319,58 | 3.026 | 32.02 |
| Bestimmung 2 | 309,76 | 3.051 | 37.01 | |
| Bestimmung 3 | 309,24 | 3.067 | 36.03 | |
| Erfahrung 2 | Bestimmung 4 | 308,34 | 2.909 | 29,91 |
| Bestimmung 5 | 308,54 | 2.9 | 29,67 | |
| Bestimmung 6 | 305,83 | 2.921 | 28.85 | |
| Erfahrung 3 | Bestimmung 7 | 299,11 | 3.035 | 29,36 |
| Bestimmung 8 | 300,07 | 2.833 | 31.14 | |
| Bestimmung 9 | 302.03 | 3.033 | 33.07 | |
| / | Bedeuten | 306,95 | 2,975 | 31,90 |
| / | CV% | 2,03 % | 2,83 % | 9,26 % |
Tabelle 4 Ergebnisse zur mittleren Präzision
3.4 Spezifität
Die Interferenz zellulärer genomischer DNA, die üblicherweise bei der Herstellung von Biologika verwendet wird, wurde auf Interferenzen mit HEK293-DNA-Nachweisreagenzien untersucht. Die Interferenzgruppe überlappte sich mit der Kontrollgruppe und es wurde keine Interferenz beobachtet (die folgende Abbildung zeigt in der Reihenfolge die Interferenzdaten genomischer CHO-, E. coli- und Pichia Pastoris-DNAs mit HEK293-DNA-Nachweisreagenzien).
Abbildung 2 Ergebnisse des Interferenzexperiments
3.5 Bestimmungsgrenze
HEK293-DNA wurde bei 30 fg/μL, 20 fg/μL, 10 fg/μL und 5 fg/μL nachgewiesen, mit 10 Replikaten für jede Konzentration. Die Ergebnisse zeigten, dass der CV bei Konzentrationen von 10 fg/μL und mehr <20 % betrug. Das heißt, die Quantifizierungsgrenze des HEK293-Wirtszell-DNA-Rückstandsnachweiskits (3G) betrug 10 fg/μL.
|
Wiederholungen Prüfling | HEK293-DNA (3G) (fg/μL) | |
| Menge | Neuberechnungsverhältnis % | |
| 1 | 11.04 | 110,40 % |
| 2 | 9,97 | 99,70 % |
| 3 | 11.12 | 111,20 % |
| 4 | 11.07 | 110,70 % |
| 5 | 11.21 | 112,10 % |
| 6 | 9,93 | 99,30 % |
| 7 | 10.25 | 102,50 % |
| 8 | 10.16 | 101,60 % |
| 9 | 10.08 | 100,80 % |
| 10 | 10.11 | 101,10 % |
| Bedeuten | 10.49 | / |
| CV% | 5,14 % | / |
Abbildung 3 10fg/μL HEK293 DNA (3G) qPCR Testergebnis
3.6 Robustheit
Dieses Kit wurde getestet und ist für die folgenden Instrumente geeignet (jedoch nicht darauf beschränkt):
| Verkäufer | Instrumentenmodelle | Verstärkungseffizienz | R2 | Bestimmungsgrenze (fg/μL) | CV% |
| Thermo | ABI 7500 | 102,84 % | 1 | 10 | 7 % |
| Thermo | ABI QuantStudio5 | 104,70 % | 0,999 | 10 | 9 % |
| Shanghai Hongshi | SLAN | 101,46 % | 0,999 | 10 | 8 % |
Tabelle 5 Ergebnisse des Geräteeignungstests
3.7 Stabilität
3.7.1 Frost-Tau-Stabilität
Das HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G) wurde durch 10-maliges Einfrieren und Auftauen getestet. Die Leistung des Kits wurde nicht beeinträchtigt.
|
Testindikatoren Gefrier-Tau-Zeiten | Parameter | T0-Zeit | 10 mal einfrieren und auftauen |
| Standardkurvenparameter | Verstärkungseffizienz | 99,34 % | 100,78 % |
| R2 | 1 | 1 | |
| Bestimmungsgrenze (30 fg/μL) | Lebenslauf | 11 % | 7 % |
Tabelle 6 Ergebnisanalyse der Frost-Tau-Stabilität
3.7.2 Beschleunigte Stabilität
Das HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G) wurde 30 Tage lang bei 2–8 °C bzw. 14 Tage lang bei 37 °C gelagert. Die Leistung des Kits wurde dadurch nicht beeinträchtigt.
|
Testindikatoren Beschleunigung Temperatur & Zeit | Parameter | T0-Zeit | 37℃ 7 Tage | 37℃ 14 Tage |
| Standardkurvenparameter | Verstärkungseffizienz | 103,83 % | 101,58 % | 100,47 % |
| R2 | 0,999 | 1 | 1 | |
| Bestimmungsgrenze (30 fg/μL) | CV% | 8 % | 5 % | 5 % |
Tabelle 7 Beschleunigte Stabilitätsergebnisanalyse
3.8 Leergrenze
Bei der No-Template-Kontrolle (NTC) handelte es sich um eine Template-Verdünnung mit 96 Wiederholungen von CT-Werten >32 (plus ROX-Kalibrierungsschwellenwertlinie auf 0,06 eingestellt).
Abbildung 4 Ergebnisse des NTC-Experiments
- 4.Referenz
4.1 Chinesische Arzneibuchkommission (ChPC). Arzneibuch der Volksrepublik China (Band Ⅲ) [S]. Beijing: China Medical Science and Technology Press, S. 542–543, 2020.
4.2 NMPA, 2007: Allgemeine Grundsätze für die technische Überprüfung der Validierung analytischer Methoden zur Qualitätskontrolle biologischer Produkte.
4.3 ICH (2022) „Analytische Methodenvalidierung Q2“, Entwurfsversion.
Bestellinformationen
| Beschreibung | Teilenummer |
| 41332ES | |
| HEK293-Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen (3G) | 41331ES |
| Vero Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen (2G) | 41307ES |
| Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen von E.coli (2G) | 41308ES |
| 18461ES | |
| MycAway™ Mycoplasma qPCR-Nachweiskit (2G) | 40619ES |