E. Coli Wirt Cell DNA Rest Nachweis Kit (2G) Validierungsbericht

E.coli Kit zur Erkennung von DNA-Rückständen in Wirtszellen (2G)

Qualifikationsübersicht (Kat.-Nr.: 41308ES60)

1. Hintergrund

Die in diesem Bericht zusammengefassten Daten werden von Yeasen Biotechnology für das Produkt „E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G)“ durchgeführt. Die zusammengefassten Daten dienen nur als Referenz für den Benutzer und der Benutzer muss die Wirtszellrückstände überprüfen. Die DNA-Methode kann durch Verwendung eigener Proben bestätigt werden, dass die Methode die Anforderungen des Benutzers erfüllen kann. Allen Laboren, die dieses Kit verwenden, wird empfohlen, die folgenden Parameter zu überprüfen: Linearität, Bereich, Genauigkeit, Präzision, Quantifizierungsgrenze, Spezifität und Robustheit.

Yeasen Biotechnology kann den detaillierten Qualifizierungsbericht für dieses Kit bereitstellen. Wenn der Benutzer diesen Bericht verwendet, werden nur die Eignung (einschließlich Präzision, Genauigkeit und Spezifität) sollten überprüft werden.

2. Experimentelle Materialien und Methoden

2.1 E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G), Anbieter: Yeasen, Kat.-Nr.: 41308ES60.

2.2 MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit, Anbieter: Yeasen, Kat.-Nr.: 18461ES60.

2.3 Nationaler Standard für E.coli-DNA-Gehalt: Kat. 270027, Lot-Nr.: 201101, Konzentration: 96,2 μg/ml, Lagerbedingungen: -70 °C, gekauft bei: National Institutes for Food and Drug Control.

2.4 Originaldaten: Die elektronische Version wurde im „Experimentalbericht“ festgehalten. die Unterdatei der übergeordneten Datei „E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G)“.

2.5 Methoden: Die für das Experiment verwendeten Materialien und Betriebsmethoden wurden grundsätzlich von Yeasen Biotechnology hergestellt oder festgelegt und über einen langen Zeitraum bewertet und überprüft. Die Entwicklung und Herstellung des Kits erfolgte gemäß dem ISO 13485-System.

3. Qualifikationsinhalte und -ergebnisse

3.1 Erfassungsbereich

Der lineare Bereich des Kits betrug 30 fg/μL~300 pg/μL mit R²=1, und die Amplifikationseffizienz betrug 101,74 % mit CV < 15 % für jeden Konzentrationstest.

Abbildung 1 E.coli DNA (2G) qPCR Standardkurve

3.2 Richtigkeit

3.2.1 Abweichung von Nationaler Standard für E.coli-DNA-Gehalt

Das E.coli-DNA-Referenzmaterial in jeder Charge des Kits wurde anhand des nationalen Standards für E.coli-DNA-Gehalt kalibriert. Das Yeasen-DNA-Referenzmaterial wies grundsätzlich keine Abweichungen vom nationalen Standard für E.coli-DNA-Gehalt auf. Kalibrierungskurve und die Abweichung des Testwertes betrug <5 %.

3.2.2 RErholung

3.2.2.1 Experiment zur Wiederfindung von Blindproben durch Aufstockung

Es wurden Proben von E. coli-DNA-Standards in hohen und niedrigen Konzentrationen hergestellt: 300 pg/µl, 3 pg/µl und 30 fg/µl. Diese wurden nach der Extraktion unter Verwendung des Magnetic Bead Method for Residual DNA Sample Pre-treatment Kit untersucht (für jede Probe wurden 2 Extraktionsreplikate und für jede Extraktion 3 Untersuchungsreplikate durchgeführt) und die Probenwiederfindungen und CVs wurden analysiert.

Bei unterschiedlichen Konzentrationen der DNA-Proben lagen die Wiederfindungsraten zwischen 70 % und 130 % und die CVs lagen alle unter 20 %.

Probentyp	Theoretische Konzentration	Extrahieren Sie 1 Mittelwert	Extrahieren Sie 2 Mittelwerte	Durchschnittliche Konzentration	Lebenslauf	Erholung
Leere Probe	/	/	/	/	/	/
Wiederfindungsprobe 1	300 pg/µL	250,56 pg/µL	262.11 pg/µL	256,33 pg/µL	4,41 %	85,44 %
Wiederfindungsprobe 2	3 pg/µL	2.29 pg/µL	2,56 pg/µL	2.42 pg/µL	7,09 %	80,77 %
Wiederfindungsprobe 3	30 fg/µL	33,62 fg/µL	32,61 fg/µL	33.12 fg/µL	14,28 %	110,39 %

Tabelle 1: Wiederfindung durch Aufstockung der Blindprobe

3.2.2.2 Simuliertes Experiment zur Probenrückgewinnung durch Spiking

Es wurden Proben der gleichen Konzentration (3 pg/µl E.coli-DNA) mit 5 verschiedenen Hintergrundlösungen (hoher Proteingehalt, hoher Nukleinsäuregehalt, hoher und niedriger pH-Wert, hoher Salzgehalt) extrahiert (für jede Probe wurden 2 Extraktionsreplikate und für jede Extraktion 3 Testreplikate durchgeführt) und die Probenwiederfindungen und CVs analysiert.

Die DNA-Probenwiederfindungen für verschiedene Hintergrundlösungen lagen zwischen 70 % und 130 %, wobei alle CVs unter 20 % lagen.

Probentyp	Theoretische Konzentration	Extrahieren Sie 1 Mittelwert	Extrahieren Sie 2 Mittelwerte	Durchschnittliche Konzentration	Lebenslauf	Erholung
Einfaches Beispiel	/	/	/	/	/	/
Hoher Proteingehalt	3 pg/µL	2,25	2.23	2.24	1,09 %	74,74 %
Hoher Kernsäuregehalt		3,93	3,96	3,95	1,56 %	131,52 %
Hoher Salzgehalt		2,69	2,67	2,68	2,63	89,20 %
Hoher pH-Wert		2,90	3,67	3.29	13,82 %	109,55 %
Niedriger pH-Wert		2,77	2,87	2,82	3,41 %	94,01 %

Tabelle 2 Grundlegende Probenwiederfindung durch Spiken

3.3 Präzision

3.3.1 Wiederholbarkeit

Wiederholen Sie den Test 10-mal für E. coli-DNA-Standards bei einer Konzentration von 3 pg/µL mit einem CV < 15 %.

Wiederholungen	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	Bedeuten	Lebenslauf
Nachweiswert (fg/µL)	3.16	2,87	2,97	2,86	2,81	2,97	3.14	3.21	3.14	3.1	3.02	4,78 %

Tabelle 3: Wiederholbarkeitsergebnisse

3.3.2 Mittlere Präzision

Drei Experimentatoren testeten unabhängig voneinander E. coli-DNA-Standardproben bei hohen und niedrigen Konzentrationen: 300 pg/µl, 3 pg/µl und 30 fg/µl. Für jede Konzentration wurden drei Replikate durchgeführt und die CVs aller neun erhaltenen Daten lagen bei <15 %.

Erfahrung	Tatsächliche Konzentration Theoretische Konzentration	E.coli DNA (2G)
		300 pg/µL	3 pg/µL	30 fg/µL
Erfahrung 1	Bestimmung 1	295,65	3.22	26,90
	Bestimmung 2	287,71	3.24	32,00
	Bestimmung 3	300,23	3.17	27,50
Erfahrung 2	Bestimmung 4	306,06	3.13	37.30
	Bestimmung 5	299,76	3.02	32,70
	Bestimmung 6	299.63	3.02	34,00
Erfahrung 3	Bestimmung 7	266,70	3.01	35,90
	Bestimmung 8	272,89	3.09	40,70
	Bestimmung 9	276,51	3.01	35,20
/	Bedeuten	289,46	3.10	33,60
/	Lebenslauf	4,89 %	3,02 %	13,18 %

Tabelle 4 Ergebnisse zur mittleren Präzision

3.4 Spezifität

Die Interferenz zellulärer genomischer DNA, die üblicherweise bei der Herstellung von Biologika verwendet wird, wurde auf Interferenzen mit E.coli-DNA-Nachweisreagenzien untersucht. Die Interferenzgruppe überlappte sich mit der Kontrollgruppe und es wurden keine Interferenzen beobachtet (die folgende Abbildung zeigt in der Reihenfolge die Interferenzdaten genomischer HEK293-, Vero- und CHO-DNAs mit E.coli-DNA-Nachweisreagenzien).

Abbildung 2 Ergebnisse des Interferenzexperiments

3.5 Bestimmungsgrenze

E.coli-DNA wurde bei 50 fg/μL, 40 fg/μL, 30 fg/μL, 10 fg/μL und 5 fg/μL nachgewiesen, mit 10 Replikaten für jede Konzentration. Die Ergebnisse zeigten, dass der CV bei Konzentrationen von 30 fg/μL und mehr <20 % betrug. Das heißt, die Quantifizierungsgrenze des E.coli-Wirtszell-DNA-Rückstandsnachweiskits (2G) betrug 30 fg/μL.

Wiederholungen Prüfling	E.coli-DNA (2 G) (fg/µL)
	Menge	Neuberechnungsverhältnis
1	29,43	98,09 %
2	29,51	98,35 %
3	32.04	106,79 %
4	26.07	86,89 %
5	34,06	113,53 %
6	33,54	111,79 %
7	26,95	89,82 %
8	27,38	91,26 %
9	27.04	90,13 %
10	26.10	87,02 %
Bedeuten	29.21	/
Lebenslauf	10,40 %	/

Abbildung 3 30fg/μL E.coli DNA (2G) qPCR-Testergebnis

3.6 Robustheit

Dieses Kit wurde getestet und ist für die folgenden Instrumente geeignet (jedoch nicht darauf beschränkt):

Verkäufer	Instrumentenmodelle	Verstärkungseffizienz	R2	Bestimmungsgrenze (fg/μL)	Lebenslauf
Thermo	ABI 7500	101,74 %	1	30	13,30 %
Thermo	ABI QuantStudio5	100,46 %	1	30	12,40 %
Bio-Rad	CFX96	99,20 %	0,999	30	13,76 %
Shanghai Hongshi	SLAN	100,40 %	0,999	30	11,67 %

Tabelle 5 Ergebnisse des Geräteeignungstests

3.7 Stabilität

3.7.1 Frost-Tau-Stabilität

Das E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G) wurde durch 10-maliges Einfrieren und Auftauen getestet. Die Leistung des Kits wurde nicht beeinträchtigt.

Testindikatoren Gefrier-Tau-Zeiten	Parameter	T0-Zeit	10 mal einfrieren und auftauen
Standardkurvenparameter	Verstärkungseffizienz	98,23 %	100,20 %
	R2	1	0,999
Bestimmungsgrenze (30 fg/μL)	Lebenslauf	15,07 %	9,66 %

Tabelle 6 Ergebnisanalyse der Frost-Tau-Stabilität

3.7.2 Beschleunigte Stabilität

E.Das E. coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G) wurde 30 Tage lang bei 2–8 °C bzw. 14 Tage lang bei 37 °C gelagert. Die Leistung des Kits wurde dadurch nicht beeinträchtigt.

Testindikatoren Beschleunigung Temperatur & Zeit	Parameter	Versuch 1		Versuch 2
		T0-Zeit	2~8℃ 30 Tage	T0-Zeit	37℃ 14 Tage
Standardkurvenparameter	Verstärkungseffizienz	97,77 %	99,81 %	98,39 %	98,65 %
	R2	1	1	1	1
Bestimmungsgrenze (30 fg/μL)	Lebenslauf	11,04 %	13,79 %	9,55 %	14,55 %

Tabelle 7 Beschleunigte Stabilitätsergebnisanalyse

4. 4.Referenz

4.1 Chinesische Arzneibuchkommission (ChPC). Arzneibuch der Volksrepublik China (Band Ⅲ) [S]. Beijing: China Medical Science and Technology Press, S. 542–543, 2020.

4.2 NMPA, 2007: Allgemeine Grundsätze für die technische Überprüfung der Validierung analytischer Methoden zur Qualitätskontrolle biologischer Produkte.

4.3 ICH (2022) „Analytische Methodenvalidierung Q2“, Entwurfsversion.

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