Mycoplasma -QPCR -Erkennung und Methodevalidierung tragen zur Weiteren

In den letzten Jahren ist die Gewährleistung der Sicherheit und Zuverlässigkeit biologischer Produkte mit der rasanten Entwicklung der Biomedizin, der Entstehung von Zell- und Gentherapien im Rahmen der COVID-19-Pandemie und der Einführung von mRNA-Impfstoffen zu einem Schwerpunkt für Regierungen und Aufsichtsbehörden weltweit geworden. Mykoplasmen-Kontamination ist eine häufige, aber typischerweise schwierig zu vermeidende Art von Kontamination. Die gesetzlichen Anforderungen schreiben die „Gewährleistung einer Mykoplasmen-Kontamination“ für Bioprozesse vor, die Zellkulturen beinhalten.

Anforderungen der Aufsichtsbehörden an Mykoplasmentests:

Die „Leitlinien für die Industrie: Charakterisierung und Qualifikation von Zellsubstraten und anderen biologischen Materialien, die bei der Herstellung viraler Impfstoffe für Indikationen bei Infektionskrankheiten verwendet werden“ der FDA schreiben eine Mykoplasmenkontrolle für Rohmaterialien, virale Samen und unverarbeitete Ernteflüssigkeiten vor.
Die Ausgabe 2020 des chinesischen Arzneibuchs, Teil III „Herstellung und Qualitätskontrolle von tierischen Zellsubstraten, die für Produktionstests biologischer Produkte verwendet werden“ verlangt Mykoplasmentests für Produktionszellen, einschließlich Master Cell Banks (MCB), Working Cell Banks (WCB) und End-of-Production Cells (EOPC).
Die „Technischen Richtlinien für die pharmazeutische Forschung und Evaluierung von Immunzelltherapieprodukten (Studie)“ empfehlen, zu wichtigen Zeitpunkten an geeigneten Zwischenproben sicherheitsrelevante Mykoplasmentests durchzuführen oder entsprechende Kontrollmaßnahmen zu ergreifen. Auch als Freigabetest für Endprodukte sind Mykoplasmentests vorgeschrieben.

Nukleinsäuretests (NAT) und traditionelle Methoden:

Vor der Einführung schneller Nachweismethoden wie der Nukleinsäureamplifikationstechnologie (NAT) wurden traditionelle Kulturmethoden und Indikatorzelltests eingesetzt. Aufgrund langer Nachweiszyklen oder Empfindlichkeitsprobleme verlängerten diese Methoden jedoch häufig die Produktions- oder Freigabezyklen oder machten eine bedingte Freigabe von Zellmaterialien auf der Grundlage einer Risikobewertung oder der Erforschung alternativer Methoden erforderlich. Mit der Weiterentwicklung von Zell- und Gentherapien besteht in der Branche eine zunehmende Nachfrage nach Mykoplasmen-Nachweismethoden mit höherer Aktualität und Empfindlichkeit. Die kurze Haltbarkeit von Produkten kann keine langen Testzeiträume überstehen, daher haben sich NAT-Methoden als günstige Alternativen herausgestellt.

Derzeit enthalten das Europäische Arzneibuch (EP) <2.6.7>, das Japanische Arzneibuch (JP) und das US-amerikanische Arzneibuch (USP) <63> alle NAT-Methoden als Mykoplasmen-Nachweismethoden. Voraussetzung für ihre Anwendung ist jedoch die Validierung dieser Methode und ein Vergleich mit herkömmlichen Methoden, um sicherzustellen, dass ihre Empfindlichkeit nicht minderwertig ist. Obwohl die Ausgabe 2020 des Chinesischen Arzneibuchs (ChP) NAT nicht als Mykoplasmen-Nachweismethode enthält, wird darin die Möglichkeit erwähnt, „andere von der nationalen Arzneimittelbehörde anerkannte Methoden“ zu verwenden. Im Mai 2022 veröffentlichte das Drug Review Center der National Medical Products Administration (NMPA) die „Technischen Richtlinien für die pharmazeutische Forschung und Bewertung von Immunzelltherapieprodukten (Studie)“, in denen vorgeschlagen wird, die Entwicklung neuartiger steriler und Mykoplasmen-Nachweismethoden für Freigabetests unter besonderen Umständen in Betracht zu ziehen, wenn das Probenvolumen begrenzt ist oder eine schnelle Freigabe erforderlich ist und die Methoden des Arzneibuchs unzureichend sind. Daher ist zu erwarten, dass NAT-Methoden zunehmend von mehr Rohstofflieferanten und Unternehmen, die Arzneimittel für neuartige Therapien (ATMP) herstellen, als Methode zur Unterstützung schneller Mykoplasmen-Freisetzungstests eingesetzt werden.

NAT-Methode - Anforderungen an die Methodenvalidierung

Der Validierungsprozess für NAT-Methoden ist ausführlich im Europäischen Arzneibuch <2.6 beschrieben.7> und Japanisches Arzneibuch, wobei ihr Inhalt im Wesentlichen übereinstimmt. Das National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC) hat außerdem einen Artikel mit dem Titel „Überlegungen zu Nukleinsäure-Nachweismethoden und methodologischer Validierung für Mykoplasmenuntersuchungen“ veröffentlicht, der Entwicklern und Anwendern von Mykoplasmen-Nukleinsäureamplifikationsmethoden in China als Leitfaden dienen soll. Spezifität, Nachweisgrenze und Robustheit sind für die Validierung von Mykoplasmen-NAT-Methoden von entscheidender Bedeutung. Wenn kommerzielle Kits für den Mykoplasmennachweis verwendet werden, kann die Eignungsvalidierung der Methode auf der Grundlage des umfassenden Leistungsberichts des Kits des Lieferanten in Kombination mit der Laborumgebung und dem Probentyp durchgeführt werden.

Validierungsbericht

Besonderheit:

Spezifität bezieht sich auf die Fähigkeit einer analytischen Methode, den Analyten in Gegenwart anderer Komponenten (wie Verunreinigungen, Abbauprodukte, Hilfsstoffe usw.) genau zu bestimmen. Das EP betont die Notwendigkeit, sich auf Kreuzreaktionen zwischen anderen Bakterienarten zu konzentrieren, die eng mit dem phylogenetischen Baum verwandt sind, wie Clostridium, Lactobacillus und Streptococcus innerhalb der grampositiven Bakterien. Auch häufige Kontaminantentypen wie menschliche DNA-Kontamination in Wirtszellen und Versuchsumgebungen sollten beachtet werden.

Nachweisgrenze:

Die Nachweisgrenze ist die niedrigste Menge eines Analyten, die in einer Probe nachgewiesen werden kann. Sie dient als qualitative Identifikationsgrundlage und muss nicht als exakter Wert quantifiziert werden. Das EP erfordert 24 Nachweisdatenpunkte für jede Mykoplasmenart bei jeder Verdünnungskonzentration. Dies kann erreicht werden, indem drei unabhängige 10-fache serielle Verdünnungen an verschiedenen Tagen mit acht wiederholten Nachweisen für jeden Verdünnungsgradienten durchgeführt werden oder indem vier unabhängige 10-fache serielle Verdünnungen an verschiedenen Tagen mit sechs wiederholten Nachweisen für jeden Verdünnungsgradienten durchgeführt werden. Eine Nachweispositivitätsrate von über 95 % kann als Nachweisgrenze betrachtet werden. Für Mykoplasmenarten, die eine Bestätigung der Nachweisgrenze erfordern, müssen Kithersteller so viele Mykoplasmenarten wie möglich abdecken, wie es die behördlichen Arzneibücher verlangen, und die Nachweisgrenzen für jede Mykoplasmenart untersuchen. Für biopharmazeutische Unternehmen ist es ratsam, auch menschliche Mykoplasmenarten zu berücksichtigen.

Wenn während des Produktionsprozesses Vogelzellen oder -materialien verwendet oder angetroffen werden, muss eine Überprüfung der Nachweisgrenze für Mycoplasma synoviae durchgeführt werden.
Wenn während des Produktionsprozesses Insekten- oder Pflanzenmaterialien verwendet werden oder angetroffen werden, sollte eine Überprüfung der Nachweisgrenze für Acholeplasma durchgeführt werden.
Porcines nasales Mykoplasma kommt in mit Mykoplasmen kontaminierten Proben sehr häufig vor und hat die Aufmerksamkeit des chinesischen Instituts für Lebensmittel- und Arzneimittelkontrolle erregt.

Im Vergleich zum Europäischen Arzneibuch werden im Japanischen Arzneibuch keine Vogelmykoplasmen erwähnt, für die eine Überprüfung der Nachweisgrenze erforderlich ist, Speichelmykoplasmen werden jedoch erwähnt.

Robustheit:

Robustheit bezeichnet die Fähigkeit einer Methode, kleine Schwankungen der Messbedingungen unbeeinflusst zu überstehen, und bildet damit die Grundlage für den Einsatz der etablierten Methode in Routinetests. Die Bewertung der Robustheit sollte sich auf die Toleranz von Mykoplasmen-Nachweismethoden gegenüber Schwankungen der Konzentration von MgCl2, Primern und dNTPs in Nachweisreagenzien, Änderungen in Nukleinsäureextraktionskits oder Extraktionsschritten und der Verwendung unterschiedlicher Nukleinsäureverstärker konzentrieren.

Vergleichbarkeitsstudie

Wenn NAT als Ersatz für Arzneibuchmethoden verwendet werden soll, muss durch Vergleiche bestätigt werden, dass NAT kulturbasierte Methoden oder Indikatorzellkulturmethoden ersetzen kann.Dabei werden in der Regel die Nachweisgrenze der Methode sowie die Spezifität (wie etwa der Bereich der Mykoplasmenabdeckung und mögliche falsch positive Ergebnisse) berücksichtigt. Für den Vergleich von Nachweisgrenzen sollte das Kriterium erfüllt sein, dass „eine Nachweisgrenze von 10 KBE/ml kulturbasierte Methoden ersetzen kann und eine Nachweisgrenze von 100 KBE/ml Indikatorzellkulturmethoden ersetzen kann.“

Für die Durchführung von Vergleichbarkeitsstudien gibt es zwei optionale Ansätze:

Durchführung synchroner Experimente mit denselben validierten Mykoplasmenstämmen sowohl für NAT- als auch für Arzneibuchmethoden zur Bestätigung der Nachweisgrenze.
Vergleichen Sie die Ergebnisse der NAT-Validierung mit früheren Validierungsergebnissen für Arzneibuchmethoden. Dabei ist jedoch eine sorgfältige Dokumentation der Bestätigungsdateien für die in beiden Methoden verwendeten Mykoplasmenstandards erforderlich.

Beschreibung	Teilenummer
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