dNTP steht für gemustertes Ribonukleotidtriphosphat, das in der PCR verwendet wird und einen wachsenden DNA-Strang amplifizieren kann. Mit anderen Worten: dNTPs in der PCR verbinden sich über Wasserstoffbrücken mit komplementären DNA-Strängen, und die wachsenden DNA-Stränge werden mithilfe der Taq-DNA-Polymerase erweitert. Was ist die spezifische Anwendung von dNTP in der PCR? Welche Eigenschaften müssen hochreine dNTPs aufweisen?

1. Was sind dNTPs?
2. Wie hoch ist die dNTP-Konzentration bei der PCR?
3. Welche Eigenschaften muss hochreines dNTP haben?
4. Verwandte Produkte und Leistung

1. Was sind dNTPs?

Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) sind Nukleotidtriphosphate, die Desoxyribose enthalten, eine Kette von Nukleotiden, die aus Ribose, einer Base und einem Phosphat besteht. dNTPs sind die wesentlichen Bausteine ​​von Nukleinsäuremolekülen und als solche notwendige Bestandteile von PCR-Mischungen, da ohne sie keine neue amplifizierte DNA erzeugt werden könnte. Die vier einzelnen Desoxynukleotide, aus denen eine DNA-Sequenz besteht, umfassen Desoxyadenosintriphosphat (dATP), Desoxythymidintriphosphat (dTTP), Desoxycytidintriphosphat (dCTP) und Desoxyguanosintriphosphat (dGTP). Darüber hinaus ist die Qualität von dNTPs auch entscheidend für den Erfolg vieler Verfahren wie PCR, cDNA-Synthese, qPCR, Sequenzierung, Klonierung und DNA-Markierung.

Es gibt vier Arten von dNTP (Desoxynukleotidtriphosphat), wobei jede eine andere DNA-Base verwendet: Adenin (dATP), Cytosin (dCTP), Guanin (dGTP) und Thymin (dTTP). Die Verwendung von dNTP während der Verlängerungsphase liefert einzelne Basen, die bereit sind, in die DNA einzubauen und sie zu verdoppeln, wie Bausteine. Da der Zweck der Technik die Synthese neuer DNA ist, liefert dNTP dem „entpackten“ Strang Nukleotide, indem es die Vorlage einer einzelnen Seite verwendet. Dadurch wird aus einem einzelnen DNA-Strang zwei, und dies kann exponentiell fortgesetzt werden, solange Reagenzien bis zur letzten Haltephase vorhanden bleiben.

2. Wie hoch ist die dNTP-Konzentration bei der PCR?

PCR ist eine In-vitro-Technik der DNA-Synthese, die durchgeführt wird, um mehrere Kopien eines DNA-Fragments von Interesse zu erzeugen, damit es unter Gelelektrophorese visualisiert werden kann. Der Zweck der PCR besteht darin, eine große Anzahl von DNA-Kopien für verschiedene nachgelagerte Anwendungen in der DNA-Sequenzierung oder DNA-Mikroarrays zu erstellen. Zu ihren Komponenten gehören DNA-Vorlagen, Primer, Puffer und Taq-DNA-Polymerase dNTP. Um den Mechanismus der PCR zu verstehen, ist es notwendig, die Bedeutung und das Prinzip der verwendeten Komponenten zu verstehen. dNTP ist eine der Schlüsselkomponenten der PCR. Die Funktion von dNTPs in der PCR besteht darin, den wachsenden DNA-Strang mit Hilfe der Taq-DNA-Polymerase zu amplifizieren und ihn durch Wasserstoffbrücken mit dem komplementären DNA-Strang zu verbinden.

Der Prozess der PCR gliedert sich in drei temperaturabhängige Schritte: Denaturierung, Annealing und Extension. Beim Denaturierungsschritt wird doppelsträngige DNA zu einzelsträngiger DNA denaturiert. Beim Annealingschritt binden die Primer an der exakten Stelle ihrer komplementären Sequenz und beim Extensionsschritt fügt die Taq DNA-Polymerase dNTPs an den wachsenden DNA-Strang an. Sobald die Stränge geöffnet sind und die Primer an die einzelsträngige DNA binden, beginnt die Taq DNA-Polymerase mit ihrer katalytischen Aktivität. Im nächsten Schritt beginnt die Zugabe von dNTPs, die mit geringerer Affinität an den P-DNA-Komplex binden, wenn das exakt komplementäre Nukleotid vorhanden ist. Kurz nachdem die Taq DNA-Polymerase anhält, kommt es zu Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen und dNTPs. Dabei entscheidet nicht das ganze Nukleotid am Anfang, sondern die Base (Stickstoffbase) auf dem dNTP über Bindung oder Nichtbindung.Wenn es zunächst eine komplementäre Base (A für T, G für C) auf der ssDNA-Vorlage findet, bildet es eine Wasserstoffbrücke zwischen ihnen. Es werden drei Wasserstoffbrücken zwischen C und G und zwei Wasserstoffbrücken zwischen A und T gebildet. Sobald die Wasserstoffbrücke gebildet ist, kommt die Taq-DNA-Polymerase dem Einbau des dNTP in den wachsenden DNA-Strang durch Bildung einer Phosphodiesterbindung nach. Nachdem die Phosphodiesterbindung gebildet ist, geht die Taq-DNA-Polymerase einen Schritt weiter und fügt neue dNTPs hinzu. Eine Phosphodiesterbindung wird zwischen dem 3'OH des Primers und dem 5'P des dNTP gebildet. Nach der Wasserstoffbrücke katalysiert die Taq-DNA-Polymerase die Reaktion, indem sie Gamma- und Betaphosphate aus den Triphosphaten der dNTPs entfernt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, werden zwei Pyrophosphate (PPi) freigesetzt. Die genaue Kinetik der Interaktion zwischen dNTPs und Taq-Polymerase in PCR-Reaktionen ist jedoch unbekannt.

Diese vier Nukleotide werden der PCR-Reaktion normalerweise in äquimolaren Mengen hinzugefügt, um eine optimale Baseneinbindung zu gewährleisten. In bestimmten Situationen, wie z. B. bei zufälliger Mutagenese durch PCR, werden jedoch absichtlich unausgewogene dNTP-Konzentrationen zugeführt, um einen höheren Grad an Fehleinbindung durch eine nicht korrekturlesbare DNA-Polymerase zu fördern. Der Faktor, der die minimale dNTP-Konzentration bestimmt, ist die DNA-Länge und -Zusammensetzung der Zielsequenz. In der PCR-Reaktion beträgt dNTP im Allgemeinen 50–200 μmol/l. Wenn die endgültige dNTP-Konzentration über 50 mmol/l liegt, kann dies die Aktivität der Taq-DNA-Polymerase hemmen. Die Konzentrationen der vier dNTPs sollten gleich sein, um Fehleinbindungen während der Amplifikation aufgrund des Fehlens eines dNTPs zu reduzieren.

Bei üblichen PCR-Anwendungen beträgt die empfohlene Endkonzentration jedes dNTP normalerweise 0,2 mM. Höhere Konzentrationen können in einigen Fällen hilfreich sein, insbesondere bei hohen Konzentrationen von Mg²⁺, als Mg²⁺ bindet an dNTPs und verringert deren Einbaurate, wodurch die unspezifische Rate erhöht wird. dNTP enthält Phosphat, das sich mit Mg verbinden kann²⁺ zur Reduzierung der Konzentration an freiem Mg²⁺, so dass die Änderung seiner Konzentration die effektive Konzentration von Mg beeinflusst²⁺Unter hohen DNA- und dNTP-Konzentrationen ist das Mg²⁺ Die Konzentration sollte entsprechend angepasst werden. Außerdem führt der Mangel an dNTPs zu unvollständigen PCR-Produkten. Allerdings können dNTPs, die die optimale Konzentration überschreiten, die PCR hemmen. Für eine effiziente Eingliederung durch DNA-Polymerase sollten freie dNTPs in der Reaktion in einer Konzentration von mindestens 0,01–0,015 mM vorhanden sein.

3. Welche Eigenschaften muss hochreines dNTP haben?

Seit ihrer Entdeckung ist die Polymerase-Kettenreaktion das unübertroffene Werkzeug in der molekulargenetischen Forschung. dNTP wird bei der PCR eingesetzt, um den wachsenden DNA-Strang zu verlängern. Selbst wenn die Qualität des dNTP im System schlecht ist, wirkt sich dies negativ auf die Eigenschaften des Endprodukts aus. Das hochreine dNTP von Yeasen eignet sich für alle Arten hochempfindlicher und reproduzierbarer DNA-Syntheseanwendungen.

Yeasen bietet gebrauchsfertige Nukleotide, Sets und Mischungen in GMP-Qualität an, die als Natriumsalze in gereinigtem Wasser bei pH 7,0 geliefert werden. Der Herstellungsprozess eliminiert Verunreinigungen und PCR-spezifische Inhibitoren, und die dNTPs werden speziell für molekularbiologische Anwendungen hergestellt. Die dNTPs werden mit präparativer HPLC gereinigt und weisen eine Reinheit von mindestens 99 % auf. Sie können in PCR-, RT-qPCR-, LAMP-, DNA-Markierungs- und DNA-Sequenzierungsprozessen verwendet werden.
Strenge Kontrollstandards und modernste Technologie gewährleisten die beste Produktqualität. Jede dNTP-Charge wird auf verschiedene Rückstände (bakterielle DNA, menschliche DNA, DNase, RNase, Endonuklease) getestet.Das Produkt ist von Charge zu Charge stabil und für alle Arten hochempfindlicher und reproduzierbarer DNA-Syntheseanwendungen geeignet.

4. Verwandte Produkte und Leistung

4.1 Keine bakteriellen DNA-Rückstände

Abbildung 1. Die Nachweisergebnisse zeigen, dass die dNTPs keine bakteriellen Genomreste aufweisen.

4.2 Keine menschlichen DNA-Rückstände

Abbildung 2. Die Nachweisergebnisse zeigen, dass dNTPs keine menschlichen Genomreste aufweisen.

4.3 Keine DNase-, RNase- und Endonuklease-Kontamination

Abbildung 3. Die Nachweisergebnisse zeigen, dass dNTPs keine DNase, RNase und Endonuklease aufweisen.

4.4 PCR-Amplifikation (20 kb DNA)

Abbildung 4. Das PCR-Amplifikationsergebnis ist das erwartete 20-kb-Produkt.

4.5 Produktinformationen

Die von Yeasen bereitgestellten Produkte sind wie folgt.

Tabelle 1.Produktinformationen