Obwohl die mRNA-Technologie während der Pandemie gute Ergebnisse erzielt hat und großes Potenzial zeigt, weist sie noch immer einige Einschränkungen auf, wie z. B. kurze Expressionszeiten und begrenzte Proteintranslation. Diese Eigenschaften können zwar ein gewisses Maß an Sicherheit bieten, werden jedoch zu Einschränkungen für Therapien wie den Proteinersatz. Dies erfordert eine wiederholte Verabreichung, um das Proteinexpressionsniveau aufrechtzuerhalten, was neue Risiken und Herausforderungen wie Immunogenität und neutralisierende Antikörper mit sich bringt.
Selbstverstärkende RNA (saRNA) kann die gleiche Immunreaktion in hundert- oder sogar tausendfach geringeren Dosen als herkömmliche mRNA erzeugen. Niedrigere Dosen bedeuten geringere Produktionskosten und weniger häufige Injektionen können potenzielle toxische Nebenwirkungen der mRNA und der Verabreichungsvektoren verringern. Derzeit befinden sich weltweit mehrere saRNA-Kandidaten in klinischen Studien. Große Unternehmen wie BioNTech entwickeln aktiv saRNA-Technologiepipelines.
Obwohl saRNA erhebliche Kosten- und Sicherheitsvorteile bietet, bringt ihre einzigartige Struktur neue Herausforderungen bei der Produktion mit sich. Das saRNA-Molekül, das die Sequenz, die die RNA-Polymerase kodiert, mit der Zielproteinsequenz kombiniert, ist viel größer (~10 kb) und komplexer (enthält mehr Sekundärstrukturen) als herkömmliche mRNA. Dies erschwert In-vitro-Transkriptionsreaktionen erheblich und verringert Ausbeute und Reinheit der saRNA-Produktion. Daher erfordert die saRNA-Produktion höhere Standards bei Synthese-, Trennungs- und Reinigungsprozessen.
Affinitätschromatographie, eine Methode zur Trennung und Reinigung, weist Probleme auf, wie z. B. eine geringe Ausbeute und Integrität des Zielprodukts. Die Kombination mehrerer chromatographischer Reinigungsverfahren (z. B. Hinzufügen von Cellulosechromatographie, hydrophober Umkehrphasenchromatographie) ist umständlich, führt zu neuen Verunreinigungen, hat niedrige Rückgewinnungsraten und ist kostspielig. Darüber hinaus wird das für die Produktion im großen Maßstab verwendete IVT-Reaktionssystem aus Systemen optimiert, die für die Synthese von 100nt-Nukleinsäuresequenzen geeignet sind, was es für saRNA, die größer als 10 kb ist, ungeeignet macht. Dies macht die Optimierung bestehender IVT-Reaktionssysteme erforderlich. Derzeit können herkömmliche mRNA-Reinigungsverfahren die Anforderungen an die Qualität industrieller Rohflüssigkeiten nicht erfüllen. Daher besteht dringender Bedarf an der Entwicklung und Optimierung eines vollständigen und effizienten Trenn- und Reinigungsprozesses in Industriequalität für selbstamplifizierende RNA.
Optimierung industrieller Produktions- und Aufbereitungsmethoden
Um ein industrielles Produktionssystem für selbstamplifizierende mRNA (saRNA) zu entwickeln, ist es unerlässlich, zunächst die Pufferionentypen und -komponenten im IVT-Kotranskriptionssystem im kleinen Maßstab zu optimieren. Dazu gehört auch die Verfeinerung der chromatographischen Puffer- und Probenwaschverhältnisse für nachfolgende Reinigungsprozesse. Diese optimierten Bedingungen können dann auf die Produktion im großen Maßstab hochskaliert werden, um zu überprüfen, ob das System die Produktionskapazität effektiv steigern und die Qualität des Rohprodukts verbessern kann.
Cotranskriptions-Cap-Adding-Reaktionssystem
Im Kotranskriptions-Cap-Adding-Reaktionssystem umfassen die T7-Pufferkomponenten 400 mM HEPES, 20 mM Spermidin, 100 mM DTT und Mg2+-Salze.
T7-Puffer – Magnesiumionensalztyp
Die Art des verwendeten Magnesiumionensalzes beeinflusst die Ausbeute und Integrität des Ziel-saRNA-Produkts.
- Bei der Co-Transkriptionssynthese von 1 mg mRNA im kleinen Maßstab führt die Verwendung von Mg(OAc)2 als Mg2+-Salz mit Werten von 100,5 µg bzw. 62,9 % zur besten Ausbeute und Integrität.
- Im Gegensatz dazu verringert die Verwendung anderer Magnesiumionensalze wie MgCl2 und MgSO4 die Ausbeute um etwa 25–50 % und die Integrität um etwa 10 %, wodurch sowohl Ausbeute als auch Integrität deutlich verringert werden.
T7-Puffer – Magnesiumionenkonzentration
Eine optimale Konzentration von Magnesiumacetat-Ionen (30–50 mM) verbessert die Ausbeute und Integrität der Ziel-saRNA, die besten Ergebnisse werden bei 35 mM erzielt.
- Bei einer Magnesiumacetat-Ionenkonzentration von 30–50 mM erreicht die saRNA-Ausbeute 88,5–100,5 µg und die Integrität beträgt 58,6–62,9 %, was gute Ergebnisse zeigt.
- Bei einer Konzentration von 35 mM sind Ausbeute und Integrität am höchsten und erreichen 100,5 µg bzw. 62,9 %.
T7-Puffer – Magnesiumionensalz kombiniert mit anderen Salzen
Durch Zugabe anderer Salze zum T7-Puffer können Ausbeute und Integrität des Zielprodukts deutlich verbessert werden.
- Der Basispuffer T7 enthält 400 mM HEPES, 20 mM Spermidin, 100 mM DTT und Mg2+-Salze, was zu einer Ausbeute und Integrität von 100,5 µg bzw. 62,9 % führt.
- Durch Zugabe eines zweiten Salzes, NaOAc, werden Ausbeute und Integrität weiter verbessert: Die Ausbeute steigt um 20–110 µg und die Integrität verbessert sich um etwa 2–8 %.
T7-Puffer - Konzentration kombinierter Salze
Wenn die zweite Salzkomponente NaOAc (Na+) eine Konzentration von 5–30 mM aufweist, verbessern sich Ausbeute und Integrität der Ziel-saRNA erheblich, wobei die beste Konzentration bei 15 mM liegt.
- Bei Na+-Konzentrationen von 3–30 mM erreicht die saRNA-Ausbeute 120–210 µg und die Integrität liegt bei 64,4–70,2 %, was gute Ergebnisse zeigt.
- Bei einer Na+-Konzentration von 15 mM sind Ausbeute und Integrität am höchsten und erreichen 210 µg bzw. 70,2 %.
Einzelne Aufreinigungsmethoden
Bei der Produktion und Reinigung von saRNA in kleinem Maßstab (<50 mg) kann der Einsatz verschiedener Reinigungsmethoden den dsRNA-Gehalt und die Proteinrückstände erheblich reduzieren und so eine hohe Ausbeute, Capping-Effizienz und Produktintegrität gewährleisten. Die Wirksamkeit der Reinigungsmethoden von der besten bis zur schlechtesten ist: Affinitätschromatographie > Lithiumchloridfällung > Ultrafiltration, Cellulosechromatographie.
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Affinitätschromatographie
Für die mRNA-Produktion im großen Maßstab ist Chromatographie vorzuziehen. Zu den Optionen gehören Umkehrphasen-, Ionenaustausch-, hydrophobe und Affinitätschromatographie, jede mit ihren Vor- und Nachteilen. Affinitätschromatographie, die häufig zur Erfassung von Poly(A)-mRNA verwendet wird, bietet Skalierbarkeit und Plattformlösungen mit Rückgewinnungsraten von über 90 %.
Die wichtigsten Strukturmerkmale der mRNA, die 5'-Kappe und der 3'-Poly(A)-Schwanz, erleichtern die Reinigung. Die Affinitätschromatographie, die der Reinigung mit magnetischen Kügelchen ähnelt, verwendet dT-gebundene Kügelchen, um mRNA mit Poly(A)-Schwanz zu erfassen. Hohe Salzkonzentrationen schirmen negative Ladungen ab und ermöglichen die Bindung über AT-Wasserstoffbrücken. Die mRNA wird bei mildem neutralem pH-Wert und geringer Leitfähigkeit eluiert.
Bei der Affinitätschromatographie für RNA kommt es zu „hoher Salzbindung und geringer Salzelution“. Pufferzusammensetzung, Molekülgröße, Temperatur und Probenkonzentration beeinflussen den Prozess erheblich. Für eine effiziente Reinigung ist die Auswahl des optimalen Salztyps und der optimalen Salzkonzentration durch Experimente unerlässlich.
Reinigung: Diese Methode liefert die höchste Produktintegrität (80,3 %), den niedrigsten dsRNA-Gehalt (0,01 µg/mg), die höchste Capping-Effizienz (96,4 %) und die geringsten Proteinrückstände (1,20 µg/mg) bei einer Ausbeute von 136 µg und einer Rückgewinnungsrate von 65 %, was sie hinsichtlich Produktreinheit und -qualität zur besten macht.
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Andere Reinigungsmethoden:
Lithiumchloridfällung
Das Prinzip der mRNA-Reinigung mit LiCl besteht darin, dass Lithium bei einem bestimmten pH-Wert die elektrostatische Abstoßung zwischen Molekülen verringern und so eine effiziente RNA-Fällung ermöglichen kann.Der Niederschlag wird dann durch Zentrifugation abgetrennt und aufgelöst, um eine reine RNA-Probe zu erhalten. Die LiCl-Fällung ist einfach, schnell, effektiv für mRNAs verschiedener Größen und liefert hochreine Produkte. Restliche Lithiumionen können jedoch die mRNA hemmen. Es wird empfohlen, die LiCl-Fällung für Lösungen mit mindestens 400 µg/ml RNA zu verwenden, um eine effiziente Reinigung sicherzustellen. Mit dieser Methode lässt sich eine hohe Ausbeute (210 µg) erzielen, die Produktintegrität beträgt jedoch nur 70,2 %, was die Produktqualität erheblich mindert. Für die Produktion im großen Maßstab ist diese Methode nicht geeignet.
Magnetperlenmethode:
Magnetkügelchen sind kleine Partikel, die sich in einem Magnetfeld richtungsweisend bewegen. Sie bestehen typischerweise aus einem Kern aus Eisenoxid und einer äußeren Beschichtung. Die Reinigung mit Magnetkügelchen ist eine gängige molekularbiologische Technik zur schnellen und effizienten Anreicherung von mRNA-Molekülen aus Gemischen. Verschiedene funktionelle Magnetkügelchen haben unterschiedliche funktionelle Oberflächengruppen (z. B. Hydroxyl, Carboxyl, Oligo(dT), Streptavidin) zur Reinigung verschiedener Biomoleküle.
Carboxylierte Magnetkügelchen können Nukleinsäuren effizient reinigen, wobei mRNA-Moleküle durch elektrostatische Wechselwirkungen unter sauren Bedingungen binden. Durch Anpassen der Bedingungen ist die selektive Bindung und Freisetzung von mRNA möglich. Längere mRNAs mit mehr freiliegenden negativ geladenen Phosphatgruppen binden leichter an die Kügelchen. Für kürzere mRNAs können größere Kügelchenvolumina erforderlich sein. Oligo(dT)-gekoppelte Magnetkügelchen nutzen ähnlich wie die Affinitätschromatographie die spezifische Bindung zwischen dem Poly(A)-Schwanz der mRNA und dem Oligo(dT) der Kügelchen.
Ultrafiltration
Dieses Verfahren führt zu der niedrigsten saRNA-Integrität, etwa 8 % niedriger als die Affinitätschromatographie, mit dem höchsten Proteinrückstand (4,58 µg/mg).
Zellulosechromatographie
Mit dieser Methode werden niedrige dsRNA-Gehalte (0,009 µg/mg) und eine hohe Capping-Rate (96,4 %) erreicht. Die Proteinrückstände sind jedoch etwas höher (5,30 µg/mg), die Rückgewinnungsrate beträgt nur 57 % und die Ausbeute 120 µg. Beide Werte sind deutlich niedriger als bei der Affinitätschromatographie (um etwa 10 % bzw. 16 µg).
Reinigungsprozess
Chromatographische Pufferkomponenten - Zugabe von Reduktionsmitteln
Durch Zugabe von Reduktionsmitteln zum chromatographischen Puffer während der Reinigung können die Produktintegrität, die Rückgewinnungsrate und die Capping-Effizienz deutlich verbessert und gleichzeitig die Mengen an dsRNA-Nebenprodukten und Proteinrückständen im Vergleich zur Nichtzugabe von Reduktionsmitteln reduziert werden.
- Ohne Reduktionsmittel:
- Ausbeute: 136µg
Wiederherstellungsrate: 65%
Integrität: 80,3 %
- dsRNA: 0,01µg/mg
Begrenzungseffizienz: 96,4 %
- Proteinrückstand: 1,20 µg/mg
- Produktreinheit und -qualität sind gut.
- Mit Reduktionsmitteln (TCPE, DTT, β-Mercaptoethanol):
- Ausbeutesteigerung um 10-40µg
- Die Wiederherstellungsrate erhöht sich um 5-18 %
- Die Integrität verbessert sich um ca. 1-5 %
Begrenzungseffizienz: 96,4 %
- dsRNA: nur 0,005 µg/mg
- Proteinrückstand: nur 0,20 µg/mg
- Deutliche Verbesserung der Produktreinheit und -qualität.
Chromatographische Pufferkomponenten - Arten von Reduktionsmitteln
Durch Zugabe verschiedener Reduktionsmittel zum Chromatographiepuffer können die Produktintegrität, Rückgewinnungsrate und Capping-Effizienz weiter verbessert und gleichzeitig dsRNA- und Proteinrückstände reduziert werden. TCPE erwies sich als das wirksamste Reduktionsmittel.
- Mit TCPE:
- Ausbeute: 175µg
- Wiederherstellungsrate: 83 %
Integrität: 85,2 %
- dsRNA: 0,005µg/mg
Begrenzungseffizienz: 96,4 %
- Proteinrückstand: 0,20µg/mg
- Hervorragende Produktreinheit und -qualität.
Chromatographische Pufferkomponenten - Konzentration von Reduktionsmitteln
Durch Zugabe von Reduktionsmitteln in einer Konzentration von 5–15 mM zum Chromatographiepuffer können die Produktintegrität, die Rückgewinnungsrate und die Capping-Effizienz deutlich verbessert und gleichzeitig dsRNA- und Proteinrückstände reduziert werden. Die optimale Konzentration beträgt 10 mM.
- Hinzufügen von 5–15 mM TCPE:
- Ausbeute: 160-178µg
- Wiederherstellungsrate: 76-85%
- Integrität: ca. 85 %
- dsRNA: 0,002-0,005µg/mg
Begrenzungseffizienz: 96,4 %
- Proteinrückstand: 0,20-0,52µg/mg
- Gute Produktreinheit und -qualität.
- Mit 10 mM TCPE:
- Ausbeute: 178µg
Wiederherstellungsrate: 85%
Integrität: 85,4 %
- dsRNA: 0,002µg/mg
Begrenzungseffizienz: 96,4 %
- Proteinrückstand: 0,20µg/mg
- Optimale Produktreinheit und -qualität.
Waschverhältnis
Durch die Kontrolle des Verhältnisses von Chromatographiepuffer zu Injektionswasser im Waschprozess (10-25):(75-90) können die Produktintegrität, die Rückgewinnungsrate und die Capping-Effizienz deutlich verbessert und gleichzeitig dsRNA- und Proteinrückstände reduziert werden. Das optimale Verhältnis beträgt 15:85.
- Verhältnis (10-25):(75-90):
- Ausbeute: 150-179µg
- Wiederherstellungsrate: 71-85%
Integrität: 84 90%
- dsRNA: 0,002-0,006µg/mg
Begrenzungseffizienz: 96,4 %
- Proteinrückstand: ca. 0,20µg/mg
- Gute Produktreinheit und -qualität.
- Mit Verhältnis 15:85:
- Ausbeute: 179µg
Wiederherstellungsrate: 85%
Integrität: 90,0 %
- dsRNA: 0,002µg/mg
Begrenzungseffizienz: 96,4 %
- Proteinrückstand: 0,20µg/mg
- Optimale Produktreinheit und -qualität.
Kombinierte Reinigungsmethoden
Durch die Kombination verschiedener Aufreinigungsverfahren können die dsRNA- und Proteinrückstände im Produkt weiter reduziert und so die Gesamtqualität verbessert werden. Die bevorzugte Reihenfolge der Aufreinigungsverfahren ist: Affinitätschromatographie > Ultrafiltration + Affinitätschromatographie > Affinitätschromatographie + Cellulosechromatographie > Cellulosechromatographie + Ultrafiltration. Die besten Ergebnisse werden nur durch Affinitätschromatographie erzielt.
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Affinitätschromatographie allein:
- Ausbeute: 179µg
Wiederherstellungsrate: 85%
Integrität: 90,0 %
- dsRNA: 0,002µg/mg
Begrenzungseffizienz: 96,4 %
- Proteinrückstand: 0,20µg/mg
- Höchste Produktreinheit und -qualität.
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Ultrafiltration + Affinitätschromatographie:
- Ausbeute: 170µg (9µg weniger als bei alleiniger Affinitätschromatographie)
- Rückgewinnungsrate: 81 % (4 % weniger als bei alleiniger Affinitätschromatographie)
Integrität: 88,5 %
- dsRNA: 0,0015µg/mg
- Proteinrückstand: 0,18 µg/mg
- Leichte Reduktion von dsRNA- und Proteinrückständen im Vergleich zur alleinigen Affinitätschromatographie, jedoch deutliche Reduktion von Ausbeute und Rückgewinnungsrate. Diese Methode ist aufwändiger, verdoppelt die Reinigungszeit und erhöht die Kosten.
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Affinitätschromatographie + Cellulosechromatographie / Cellulosechromatographie + Ultrafiltration:
- dsRNA: 0,005µg/mg niedriger als bei Einzelmethoden
- Ausbeute: 60-100µg weniger
- Wiederherstellungsrate: 30-40 % niedriger
- Mehr Schritte führen zu höheren Arbeits- und Materialkosten.
Produktion im großen Maßstab
Bei der Produktion im großen Maßstab erhöht sich die Ausbeute an selbstamplifizierender mRNA durch den Einsatz von Affinitätschromatographie, Affinitätschromatographie in Kombination mit Cellulosechromatographie oder Ultrafiltration in Kombination mit Affinitätschromatographie deutlich auf 140–185 µg bei einer Rückgewinnungsrate von 67–88 %. Die Produktintegrität beträgt 93–94 %, der dsRNA-Gehalt wird auf 0,0018–0,0020 µg/mg kontrolliert, die Capping-Effizienz erreicht 96,1–96,4 % und die Proteinrückstände werden auf 0,04–0,05 µg/mg begrenzt. Dies zeigt eine gute Skalierbarkeit und Effizienz für die Produktion im großen Maßstab.
Referenz:
[8] Industrielle Produktions- und Trennungsreinigungsmethoden für selbstamplifizierende mRNA-Rohflüssigkeit und ihre Anwendungen [P]. Patent: CN118048418A. 2024.05.17.
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