Die Cap-Struktur ist ein wesentlicher Bestandteil bei der Entwicklung von mRNA-Impfstoffen und -Therapeutika. Die synthetische mRNA-Technologie basiert auf Cap1, um die Stabilität und Translationseffizienz zu verbessern und die angeborene Immunerkennung von mRNA durch Toll-like-Rezeptoren (TLRs) und andere Immunsensoren zu reduzieren, wodurch eine unerwünschte Immunaktivierung minimiert wird. Dies verhindert unerwünschte Entzündungsreaktionen und verbessert so die Stabilität und Wirksamkeit der therapeutischen mRNA in menschlichen Zellen.
Frühe Entdeckung und Cap0-Struktur
Mitte der 1970er Jahre wurde bei der Erforschung eukaryotischer mRNA eine 5'-terminale Struktur entdeckt, die heute als Cap0 bekannt ist und bei der eine N7-Methylguanosin-Kappe (m7G) an das erste Nukleotid am 5'-Ende angehängt ist. Diese Modifikation schützt mRNA vor dem Abbau durch Exonukleasen, unterstützt den nuklearen Export und fördert die Ribosomenerkennung für die Translationsinitiierung. Cap0 war die erste charakterisierte Kappenstruktur, deren Methylierung auf die Guanosin-Kappe selbst beschränkt war. Die Entdeckung dieser 5'-Kappe und ihrer Funktionen markierte einen bedeutenden Durchbruch im Verständnis eukaryotischer mRNA-Kappen und ihrer Rolle bei mRNA-Modifikationen.
Die Entstehung von Cap1
Die Cap1-Struktur, ein entscheidendes Merkmal eukaryotischer mRNA, spielt eine zentrale Rolle bei mRNA-Stabilität, Translation und Immunerkennung. Die mRNA-Cap-Struktur, bestehend aus einem N7-Methylguanosin (m7G), das über eine 5'-5'-Triphosphatbindung an das erste Nukleotid gebunden ist, entwickelte sich aus frühen Studien zu posttranskriptionellen Modifikationen eukaryotischer mRNA in den 1970er Jahren.
Struktur von 5'-endgecappten mRNAs.【1】 Weitere Untersuchungen ergaben, dass in den meisten eukaryotischen mRNAs das erste Nukleotid nach der Cap (Position +1) auch an der 2'-O-Position der Ribose methyliert ist, ein Vorgang, der als 2'-O-Methylierung bekannt ist. Diese Entdeckung, bekannt als Cap1-Struktur (m7GpppNm), fügte den mRNA-Modifikationen eine weitere Ebene von funktioneller Bedeutung hinzu. Die Cap1-Modifikation verfeinerte die mRNA-Stabilität und verhinderte die Immunerkennung durch das angeborene Immunsystem, insbesondere in Säugetierzellen, wo sie dazu beiträgt, der Erkennung durch Mustererkennungsrezeptoren wie RIG-I, TLRs und MDA5【2】 zu entgehen. Dies war sowohl für den mRNA-Stoffwechsel als auch für die Weiterentwicklung mRNA-basierter Technologien, einschließlich mRNA-Impfungen und Gentherapieanwendungen, von entscheidender Bedeutung.
Technische Herausforderungen in der mRNA-Industrie und aktuelle Lösungen
Bei der großflächigen Anwendung und Optimierung von mRNA-Impfstoffen gibt es noch einige technische Herausforderungen, darunter Probleme mit hochdosierter mRNA, Immunreaktionen, Stabilität und Verabreichung. Eine große Herausforderung in der mRNA-Industrie ist die Notwendigkeit hoher mRNA-Dosen, um eine robuste Immunreaktion hervorzurufen. Dies ist auf mehrere Faktoren zurückzuführen:
Schneller Abbau: mRNA ist von Natur aus instabil und anfällig für den Abbau durch in biologischen Systemen vorhandene Decapping-Enzyme und Ribonukleasen (RNasen).
Begrenzte Translationseffizienz: Die Effizienz, mit der mRNA in Protein übersetzt wird, kann variieren. Es sind größere Mengen mRNA erforderlich, um ausreichende Antigenspiegel für eine Immunantwort zu erzeugen. Die Translationseffizienz hängt mit der Affinität von Cap1 und dem Translationsinitiationsfaktor eIF4E zusammen.
Die Bildung des grundlegenden Translationsinitiationskomplexes bei Eukaryoten.【3】
Immunogenität und unerwünschte Immunreaktionen: Die dritte große Hürde ist die angeborene Immunreaktion, die durch die mRNA selbst ausgelöst werden kann, insbesondere bei dsRNA oder unvollständiger mRNA. Während ein gewisses Maß an Immunaktivierung erwünscht ist, um das adaptive Immunsystem zu stimulieren, kann eine übermäßige Aktivierung zu Entzündungsreaktionen führen, die die Wirksamkeit des Impfstoffs verringern oder Nebenwirkungen verursachen können.
Geschichte der Verschließtechnologie
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Enzymatische Capping-Technologie: Beim enzymatischen Capping, das in den frühen Tagen der mRNA-Forschung eingeführt wurde, werden Capping-Enzyme wie Guanylyltransferase und Methyltransferase verwendet, um posttranskriptionell ein natürliches 5'-Cap hinzuzufügen. Diese Methode gewährleistet eine hohe Genauigkeit und Capping-Effizienz bei der mRNA-Translation, insbesondere für therapeutische Anwendungen.
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Analoga synthetischer Kappen (1980er-2000er Jahre): Forscher entwickelten synthetische Cap-Analoga für die In-vitro-Synthese von gecapter mRNA, um die Funktion und Genexpression von mRNA zu untersuchen. Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) ist ein synthetisches Cap-Analogon, das eine falsche Cap-Inkorporation während der mRNA-Synthese verhindern und so die Translationseffizienz von mRNA für Impfstoffe und Gentherapien verbessern soll. Allerdings sind die Capping-Effizienz und der Ertrag des ARCA-Cappings gering.
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Cap1-Technologie (2010er Jahre): Cap1 von TriLink ist eine ko-transkriptionelle Capping-Methode, die den Prozess vereinfacht, indem die Kappe direkt während der mRNA-Synthese eingebaut wird. Diese Methode steigert die Effizienz und liefert einen hohen Prozentsatz korrekt gecappter mRNA, was sie ideal für groß angelegte therapeutische Anwendungen wie mRNA-Impfstoffe macht.
Derzeit spielen enzymatische Capping-Technologien bei der Entwicklung mRNA-basierter Therapien, einschließlich COVID-19-Impfstoffen, eine entscheidende Rolle, da sie die Stabilität und wirksame Translation therapeutischer mRNA gewährleisten.
Vergleich von Enzymatic Capping, der nächsten Generation LZCap Capping und die Capping-Methode der ersten Generation (ARCA)
Entwicklung von Kappenanaloga der nächsten Generation
Unser Ziel war es, Cap-Analoga zu entwickeln, die gegen Decapping-Enzyme resistent sind, eine hohe Affinität zu eIF4E aufweisen, um die Translationseffizienz zu verbessern, und eine geringere Immunogenität aufweisen. Diese Fortschritte sind entscheidend für die Verbesserung der Wirksamkeit mRNA-basierter Therapien, einschließlich Krebsbehandlungen und Gentherapieanwendungen.
Entwerfen von LZCap
Bei der Entwicklung von LZCap haben wir uns hauptsächlich darauf konzentriert, ein Cap-Analogon mit hoher Affinität zu eIF4E zu entwickeln. Enzyme haben eine relativ „spezifische“ Erkennung von Substraten. Daher bemühen wir uns bei der Entwicklung einer neuen Cap-Struktur, die Ähnlichkeit mit natürlichen/bekannten Strukturen so weit wie möglich beizubehalten. Die natürliche Struktur hat eine Ribose 3' OH, die modifiziert werden kann (z. B. Methylierung). Aufgrund dieser Überlegung haben wir uns entschieden, aus Neuheitsgründen ein Kohlenstoffatom an der 3'-Position hinzuzufügen, gefolgt von einem NH, um die Wasserstoffbrückenbindung von OH nachzuahmen, und dann einer Acetylgruppe, um die Basizität von NH zu verringern und seine Wasserstoffbrückenbindungsfähigkeit zu verbessern. Die Aktivität von LZCap ist besser als die von methyliertem natürlichem Cap, möglicherweise aufgrund erhöhter Wasserstoffbrückenbindung. Im Vergleich zu den Methyl- und Methoxygruppen kann die Acetylaminogruppe auch die Van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen dem Substrat (Cap) und dem initiierenden Faktor (Enzym) erhöhen.
Stabilität der Acetylaminogruppe
Die Acetylaminogruppe ist bereits ausreichend stabil. Sie ist viel stabiler als die 7-Methylposition und die Phosphodiesterbindung, die die am wenigsten stabilen Teile der Kappe sind.
Ertrag und Capping-Effizienz von LZCap
Mit LZCap AG(3'Acm)-Cap beträgt die Luciferase-mRNA-Capping-Effizienz etwa 97,59 %, und mit 1 μg DNA-Vorlage können in einer standardmäßigen In-vitro-Transkriptionsreaktion (IVT) mit T7-RNA-Polymerase bis zu 200 μg gecappte mRNA gewonnen werden. Die mRNA-Reinheit beträgt nach einfacher LiCl-Fällung bis zu 99 %. Diese hohe Capping-Effizienz und Ausbeute machen LZCap zu einer attraktiven Option für verschiedene Anwendungen, einschließlich Proteinproduktion und Gentherapie.
Die Cap-Struktur ist ein wesentlicher Bestandteil der Entwicklung von mRNA-Impfstoffen und Therapeutika.Die synthetische mRNA-Technologie nutzt Cap1, um die Stabilität und Translationseffizienz zu verbessern und die Erkennung der mRNA durch Toll-like-Rezeptoren (TLRs) und andere Immunsensoren durch das angeborene Immunsystem zu reduzieren. Dadurch wird eine unerwünschte Immunaktivierung minimiert. Dies verhindert unerwünschte Entzündungsreaktionen und verbessert so die Stabilität und Wirksamkeit der therapeutischen mRNA in menschlichen Zellen.
| Produkt | Kappe AG (3'-OMe-7mG) | LZCap AG (3'Acm) | AG (keine Deckelung) |
| mRNA-Ausbeute (μg) | 164 | 173 | 200 |
MS-Analyse der Capping-Effizienz von LZCapped Luciferase mRNA mit RNAse H-basierter Methode. Die Capping-Effizienz beträgt ca. 97,59 %,
Wie ist die mRNA-Stabilität gegenüber dem Decapping-Enzym
mRNAs mit LZCap AG (3'Acm) und LZCap AG M6 (3'Acm) zeigen eine höhere Resistenz gegenüber dem Decapping-Enzym (NEB). Es ist anzumerken, dass CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) ebenfalls resistent gegenüber dem Decapping-Enzym ist, das reguläre Cap AG (3'-OMe-7mG) jedoch keine Resistenz zeigt.
Wie ist die Bindungsaffinität von LZCap zu eIF4E?
Wie steht es mit der Proteinexpression von mit LZCap AG(3'Acm) gecappter mRNA?
Die Expression von LZCap AG(3'Acm)-gecapter Luciferase-mRNA ist in verschiedenen Zelllinien* (3T3-L1, Hela, JAWs, HEK293T und Huh7) deutlich höher als die von Cap1-Analogon (3'-OMe-7mG)-gecapter mRNA. Das Experiment mit 130 Wiederholungen zeigte eine durchschnittlich etwa 1,5-mal höhere Expression von LZCap AG(3'Acm)-gecapter Luciferase-mRNA als von (3'-OMe-7mG)-gecapter mRNA. Ähnliche Ergebnisse werden bei Mäusen beobachtet. Der Proteinexpressionsgrad kann bei unterschiedlichen mRNA-Sequenzen leicht variieren.
Haben Sie weitere Tierdaten?
Die Expressionseffizienz von LZCap AG(3'Acm) oder LZCap AG(3'FMom) gedeckelten
GLuc-kodierende mRNA zeigt im Vergleich zu CapAG (3'-OMe-7mG)-gekappten mRNAs bei Javaneraffen und -schweinen eine höhere In-vivo-Expression.
Wie steht es um die angeborene Immunogenität von mit LZCap AG gecappten mRNAs?
LZCapAG (3'Acm)-gecapte mRNAs zeigen eine geringe angeborene Immunogenität. TLR8, TLR7, IL-1A und B spielen eine wichtige Rolle bei der durch ungecapte RNA ausgelösten Immunantwort. Die In-vivo-Studien zur Immunogenitätsanalyse von LZCap-mRNA zeigten, dass ungecapte RNA bei Mäusen signifikante Veränderungen im Transkriptionsniveau immunbezogener Faktoren verursachte. Sowohl LZCap- als auch 3'-OMe-7mG-gecapte mRNAs zeigen nach einer einzigen RNA-stimulierten Injektion ein ähnlich niedrigeres Transkriptionsniveau von Immunfaktoren bei Mäusen.
Haben Sie Sicherheitstests durchgeführt?
Ja, wir haben einen Zytotoxizitätstest, eine Studie zur Hemmung der menschlichen Polymerase und einen Ames-Test durchgeführt.
- Für das Nukleosidmonomer 3'-Acm-7mG (CC50 > 10.000 nM) wird in 293T-, Huh7-, MRC5-, THP1- und U87MG-Zellen keine oder nur eine geringe Zytotoxizität beobachtet.
- Menschliche DNA-Polymerase (α,β, γ und Klenow) und Studien zur Aktivitätshemmung der mitochondrialen RNA-Polymerase (hPOLRMT) zeigen, dass 3'-Acm-7mG TP die menschliche DNA- oder RNA-Polymerase nicht hemmt.
- Der bakterielle Rückmutationstest (Ames) erkennt damit verbundene genetische Veränderungen sowie genotoxische Karzinogene bei den meisten Nagetieren und Menschen. Der Ames-Test zeigte, dass 3'-Acm-7mG keine Genotoxizität aufweist.
Ist dieses Produkt patentiert?
Ja. Das Patent wurde in den USA erteilt.
Bestellinformationen
| Produktname | Technische Daten | Katalog-Nr. |
| LZCap AG (3'Acm)（ 100 mM） | 100 μl, 1 ml | 10684ES |
| LZCap AU(3'Acm)（ 100 mM） | 100 μl, 1 ml | 10685ES |
| LZCap GG(3'Acm)（ 100 mM） | 100 μl, 1 ml | 10686ES |
| LZCap AG (3'Ma-Cy5)（ 25 mM） | 100 μl, 1 ml | 10688ES |
| LZCap AG (3'Ma-Cy7)（ 25 mM） | 100 μl, 1 ml | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 mM) | 100 μl, 1 ml | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Biotin) (25 mM) | 100 μl, 1 ml | Anfrage |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) | 100 μl, 1 ml | Anfrage |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) | 100 μl, 1 ml | ICHAnfrage |
| LZCap (AG(3'Acm) Glühwürmchen-luc-mRNA (1μg/μL) | 100 μl, 1 ml | ICHAnfrage |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) | 100 μl, 1 ml | ICHAnfrage |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) | 100 μl, 1 ml | ICHAnfrage |
| LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 μg/μL) | 100 μl, 1 ml | Anfrage |
| LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL) | 100 μl, 1 ml | ICHAnfrage |
| LZCap (AG(3'Acm) Gluc mRNA (1μg/μL) | 100 μl, 1 ml | ICHAnfrage |
Referenz:
- Molekulare Mechanismen der RNA-Capping und Methylierung des Coronavirus, Virologica Sinica 31(1)
- mRNA-Impfstoffe – eine neue Ära in der Vakzinologie. Nat. Rev. Drug.Entdeckung. 17, 261–279 (2018).
- Regulation der Translationsinitiierung durch RNA-bindende Proteine bei Säugetieren: Die Modulation des Translationsinitiierungskomplexes durch Trans-Acting-Faktoren, Zellen 2021, 10(7), 1711