Aufgrund seiner hohen Nachweisempfindlichkeit, starken Spezifität und der Möglichkeit, sowohl qualitative als auch quantitative Nachweise durchzuführen, bietet das Next-Generation-Sequencing (NGS) äußerst breite Anwendungsaussichten in der klinischen und wissenschaftlichen Forschung in Bereichen wie der Erkennung von Krankheitserregern, Tumormutationen und Reproduktionsgenetik. Der Aufbau einer Bibliothek ist ein zentraler Schritt bei NGS und wirkt sich direkt auf die Sequenzierungsqualität aus. Basierend auf den Richtlinien zur Registrierungsprüfung für In-vitro-Diagnostika (IVD) müssen Forschungsdaten zu den wichtigsten Rohstoffen bereitgestellt werden. Eine umfassende Analyse und Überprüfung sollte durchgeführt werden, indem Faktoren wie die grundlegenden Informationen, Parameterindikatoren und Bezugsquellen der Rohstoffe kombiniert werden, um die am besten geeignete Rohstoffquelle zu bestimmen. Der konventionelle Prozess zum Aufbau einer DNA- und RNA-Bibliothek umfasst hauptsächlich Schlüsselschritte wie die Synthese von cDNA, die DNA-Fragmentierung, die Adapterligation und die Amplifikation der Bibliothek. Die verschiedenen Schritte beinhalten viele Arten von Rohstoffenzymen. Das Screening der Rohstoffenzyme verlängert den Forschungszyklus. Auf dieser Grundlage sind kostengünstige und einfache Bibliotheksaufbaumodulprodukte zu einer neuen Wahl für die Entwicklung von IVD-Produkten geworden.
Abbildung 1. Konventioneller Prozess zur Konstruktion einer DNA-Bibliothek (links) und Prozess zur Konstruktion einer RNA-Bibliothek (rechts) am Beispiel der Illumina-Plattform
Die Reverse-Transkriptionssynthese ist der Kern von RNA-Seq, Neu Art der hohen Effizienz-Reverse-Transkriptase, die mehrere Funktionen wie hohe Empfindlichkeit, hohe Ertrag von cDNA und die Kompatibilität mit Vorlagen komplexer Strukturen ist ein Forschungsschwerpunkt. Die ZymeEditor™-Enzymmodifizierungsplattform von
Abbildung 2. Leistung von 13488ES bei Anwendung in RNA-Seq
Aufgrund der geringen Leselänge der Sequenzierungsplattform muss die DNA vor dem Aufbau der Bibliothek zufällig fragmentiert werden. Im Anfangsstadium war die enzymatische Fragmentierung aufgrund von Problemen mit Einheitlichkeit und Verzerrung entmutigend.
Abbildung 3. Fragmentierungseffekte verschiedener DNA-Fragmentierungsenzyme: stark wirkendes Fragmentierungsenzym (links) und schwach wirkendes Fragmentierungsenzym (rechts)
Die Bibliothekskonvertierungsrate ist ein wichtiger Indikator zur Bewertung der Bibliotheksqualität. Eine hohe Bibliothekskonvertierungsrate bedeutet in gewissem Maße eine größere Bibliotheksfülle und eine bessere Einheitlichkeit der Sequenzierungsdaten. Bei der herkömmlichen T4-DNA-Ligase liegt der Schwerpunkt auf der Optimierung einer hocheffizienten Ligation, allerdings neigen Fragmente zur Selbstligation, was die Bibliothekskonvertierungsrate verringert und den Bibliotheksreichtum und die Sequenzierungsqualität beeinträchtigt. Die Enzym-Engineering-Plattform
Abbildung 4. Thermische Stabilität und Linkerrestanalyse von 12996ES
Für die Methoden zur NGS-Bibliotheksvorbereitung werden alle PCR-Amplifikationsenzyme benötigt. Die meisten hochpräzisen DNA-Polymerasen haben eine 5'→3'-Polymeraseaktivität und eine 3'→5'-Exonukleaseaktivität. Es kann DNA in der 5'→3'-Richtung synthetisieren und dabei die irrtümlich eingebauten Basen korrigieren, Auf diese Weise können DNA-Fragmente schnell und mit hoher Genauigkeit amplifiziert werden. Aber nur wenige Enzyme sind speziell für NGS konzipiert, Es gibt nicht viele Produkte zur Bibliotheksverstärkung, die effizient, genau, spezifisch und in der Lage sind, Ziele unterschiedlicher Größe und mit unterschiedlichem GC-Gehalt ohne Verzerrung zu verstärken und gleichzeitig über die Möglichkeit verfügen, Primer im Voraus vorzumischen.
Abbildung 5. Stabilitäts- und Verstärkungsfehlerratenanalyse von 12980ES
Zusätzlich zu der oben genannten Reihe von NGS-Bibliotheksbaumodulprodukten, Wir bieten auch Rohenzymprodukte aus einer Hand, um den kombinierten Anforderungen verschiedener Kunden gerecht zu werden. Die Rohstoffprodukte für den NGS-Bibliotheksbau von
| Produktkategorie | Produktname | Kat.-Nr. | Bemerkung |
| Effiziente cDNA-Synthese | Hifair™ Ultra-Reverse-Transkriptase (200 U/μL) | 14604ES | Reverses Transkriptionsenzym |
| Hieff NGS™ ds-cDNA Synthese Kit | 13488ES | cDNA-Synthesemodul | |
| DNA Fragmentierung & End-Repair & A-Tailing | Hieff™ Schmerase | 12907ES | DNA-Fragmentase |
| Hieff NGS™ OnePot Pro DNA-Fragmentierungsmodul (Endreparatur und dA-Tailing plus) | 12619ES | DNA Fragmentierung & End-Repair & A-Tailing Modul | |
| Reparatur & A-Tailing | Hieff NGS® Fast-Pace End Repair/dA-Tailing-Modul | 12608ES | End-Repair & A-Tailing Modul |
| Adapterligatur | 10299ES | T4 DNA-Ligase | |
| Bibliothekserweiterung | 2× Ultima HF-Verstärkungsmix | 13344ES | Hochpräzises Enzym |