Die Quantifizierung von Nukleinsäuren ist eines der grundlegendsten Experimente in der Molekularbiologie und hat direkte Auswirkungen auf das Ergebnis nachfolgender Experimente. Die Genauigkeit der Quantifizierung von Nukleinsäuren ist entscheidend. Derzeit gibt es zwei Hauptmethoden zur Quantifizierung von NGS-Bibliotheken: die Ultraviolettabsorptionsmethode und die Fluoreszenzfarbstoffmethode.

Bei der Ultraviolettabsorptionsmethode wird zur Quantifizierung die Absorption von DNA und RNA bei 260 nm mit einem Spektralphotometer gemessen. Außerdem wird die Reinheit von Nukleinsäuren durch Berechnung des OD260/OD280-Verhältnisses geschätzt. Die ermittelten Werte sind jedoch sehr anfällig für Störungen durch andere Verunreinigungen wie freie Nukleotide, Salze und organische Verbindungen.

Bei der fluorometrischen Qubit-Quantifizierung werden Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, die sich spezifisch an doppelsträngige DNA, einzelsträngige DNA, RNA oder Proteine ​​binden. Bei Anregung durch eine Lichtquelle mit einer bestimmten Wellenlänge emittieren die Farbstoffe eine Fluoreszenz, die nicht durch andere Verunreinigungsmoleküle beeinflusst wird, die in der Probe vorhanden sein können. Die Fluoreszenzintensität ist proportional zur Konzentration der Zielmoleküle in der Probe.

Tabelle 1. Vergleich der gängigen Methoden zur Nukleinsäurequantifizierung

Ziel	UV-Abs (Nanotropfen)	Qubit DNA HS	Qubit DNA BR	Qubit-RNA	Qubit-Einzelstrang-DNA
Art der Nukleinsäure	DNA, RNA	DNA-Doppelstrangbruch	DNA-Doppelstrangbruch	RNA	ssDNA, Oligo
Probenkonzentration (ng/μL)	2 ng/µl–15 µg/µl	10 pg/µL-100 ng/µL	0,1 ng/µl – 1000 ng/µl	250 pg/µl-1000 ng/µl	50 pg/µl – 200 ng/µl
Vorteil	Höhere Bestimmungsgrenze	Gute Spezifität	Breites Quantifizierungsspektrum	Hochselektiv für RNA	Gut verträglich
Einschränkungen	Schlechte Spezifität	Während der Anwendung vor Licht schützen	Während der Anwendung vor Licht schützen	Während der Anwendung vor Licht schützen	Schlechte Spezifität und bindet auch dsDNA

UV-Absorption und Qubit-Fluorometrie-Quantifizierung haben jeweils ihre Vorteile und können sich gegenseitig ergänzen. Für die vorläufige Quantifizierung routinemäßiger Nukleinsäureproben zur Bestimmung von Konzentration, Reinheit und Vorhandensein von Verunreinigungen kann die Absorptionsquantifizierungsmethode gewählt werden. Die Qubit-Quantifizierung eignet sich besser für wertvolle Proben mit geringer Konzentration oder für die präzise Quantifizierung, die für nachfolgende Experimente erforderlich ist, wie etwa Next-Generation-Sequenzierung und quantitative Echtzeit-PCR.

Yeasen hat mehrere Qubit-Quantifizierungsprodukte auf den Markt gebracht: dsDNA HS Assay Kit für Qubit^® (Kat.-Nr. 12640), Gebrauchsfertig: 1× dsDNA HS Assay Kit für Qubit^® (Kat.-Nr. 12642), ssDNA-Testkit für Qubit^® (Kat.-Nr. 12645) und dsDNA BR Assay Kit (Kat.-Nr. 12643), die seit ihrer Einführung viel Lob erhalten haben.

Lösung 1 dsDNA HS Hochempfindliche Quantifizierung

Gebrauchsfertiges dsDNA-Quantifizierungs-Premix – 1× dsDNA HS Assay Kit für Qubit^®

^{Einfache Handhabung: Gebrauchsfertige Premix, kein Vormischen nötig;}

^{Hohe Empfindlichkeit: Nachweisbare Konzentrationen ab 50 pg/μL;}

^{Gute Stabilität: Das Fluoreszenzsignal hält 3 Stunden an und eine Lagerung bei Raumtemperatur über 20 Tage beeinträchtigt die Genauigkeit der Quantifizierung nicht.}

^{A. Hervorragende Stabilität: Bei Lagerung bei Raumtemperatur über 2 Wochen bleibt die Stabilität erhalten (der gemessene Wert weicht vom theoretischen Wert um weniger als 10 % ab).}

Tabelle 2. Stabilitätstest verschiedener Proben bei 4 °C und Raumtemperatur im Vergleich zu Wettbewerbern

Quantitative Reagenzien	Bestimmt Konzentration von λDNA (ng/μL)
	0T		1T		3D-Modell	7 Tage			10 Tage		14 Tage
T* 4℃	0,51		0,496		0,524	0,534			0,495		0,499
Yeasen 4℃	0,51		0,508		0,513	0,475			0,48		0,495
Yeasen Raumtemperatur Lagerung	0,51		0,517		0,506	0,486			0,506		0,523
Quantitative Reagenzien	Bestimmt Konzentration von Kälber-gDNA (ng/µL)
	0T	1T		3D-Modell			7 Tage	10 Tage		14 Tage
T* 4℃	55,3	53,5		55,40			57,9	55,8		58
Yeasen 4℃	59,4	55,4		57,8			56.1	56,3		59,8
Yeasen Raumtemperatur Lagerung	59	55,7		61,3			58	58,7		56.1

B. Hohe Empfindlichkeit, gute Chargenstabilität

Tabelle 3.Stabilitätstest verschiedener Chargen

Batch	Probe	N*			Yeasen			Fehler
		Konzentration1 (ng/µL)	Konzentration2 (ng/µL)	Durchschnitt (ng/µL)	Konzentration1 (ng/µL)	Konzentration2 (ng/µL)	Durchschnitt (ng/µL)
D9801060	DNA-Moleküle	0,3160	0,3250	0,3205	0,320	0,320	0,320	0,16 %
D8801050		0,3310	0,3320	0,3315	0,319	0,306	0,3125	5,73 %
D7813110		0,345	0,358	0,352	0,334	0,329	0,332	-6,03 %

Lösung 2 dsDNA BR Broad Range Quantifizierung

Breites Spektrum an dsDNA-Quantifizierung – dsDNA BR Assay Kit

Hohe Empfindlichkeit: Nachweisbare Konzentrationen ab 50 pg/μL;

Hervorragende Linearität: Gute Linearität im Bereich von 2–1000 ng;

Hohe Toleranz gegenüber Schadstoffen: Kann übliche Schadstoffe tolerieren.

Tabelle 4. Stabilität und Toleranz gegenüber Verunreinigungen im Vergleich zu Wettbewerbern

Yeasen BR						T* BR
Standard	RFU1	RFU2	Durchschnitt	Fehler		Standard	RFU1	RFU2	Durchschnitt	Fehler
Staffel 1	159,63	160,71	160.17	1 %		Staffel 1	216.17	211,56	213.865	-2 %
Staffel 2	24497,0	25078.64	24787,82	2 %		Staffel 2	20532.46	20452.26	20492.36	0 %
Messung						Messung
Schadstoff	Konzentration in 10 μL Probe	Konzentration1	Konzentration2	Durchschnitt	Zu testen/kontrollieren	Schadstoff	Konzentration in 10 μL Probe	Konzentration1	Konzentration2	Durchschnitt	Zu testen/kontrollieren
Kontrolle (H2O)	/	49	48,6	48,8	0,0 %	Kontrolle (H2O)	/	49,8	48	48,9	0,0 %
BSA	1 mg/ml	51,8	52	51,9	6,4 %	BSA	1 mg/ml	54	51,2	52,6	7,6 %
Ethanol	20 %	44,6	44	44.3	-9,2 %	Ethanol	20 %	44,8	43.4	44.1	-9,8 %
Chloroform	4,00 %	49,0	49,8	49,4	1,2 %	Chloroform	4,00 %	50,0	47	48,5	-0,8 %
Sicherheitsdatenblatt (SDS)	0,2 %	46,6	45,8	46.2	-5,3 %	Sicherheitsdatenblatt (SDS)	0,2 %	53.2	51,6	52,4	7,2 %
Trition-X100	0,20 %	41,6	40,6	41.1	-15,8 %	Trition-X100	0.20 %	53	51	52,0	6,3 %
dNTPs	2 mm	44.2	45	44,6	-8,6 %	dNTPs	2 mm	47,8	46,4	47.1	-3,7 %

Lösung 3 ssDNA-Quantifizierung

Die ideale Wahl für die Quantifizierung von ssDNA – Kostengünstiges ssDNA-Assay-Kit für Qubit^®

^{Hohe Empfindlichkeit: Nachweisbare Konzentrationen ab 50 pg/μL;
Hervorragende Linearität: Gute Linearität im Bereich von 0–200 ng;
Stabiles Signal: Hervorragender Farbstoff in Kombination mit einem verbesserten optimierten Puffer kann eine stabile Fluoreszenzintensität bei Raumtemperatur aufrechterhalten und ist selbst in Umgebungen mit häufigen Verschmutzungen wie Salzen, freien Nukleotiden, Lösungsmitteln, Reinigungsmitteln oder Proteinen hervorragend anwendbar, wodurch eine genaue Quantifizierung gewährleistet wird;
Gute Stabilität: Keine signifikanten Leistungsänderungen nach 6-monatiger Behandlung bei 4 °C oder 25 °C;
Breites Anwendungsspektrum: Einfacher Bedienungsablauf, der eine schnelle Quantifizierung von Oligonukleotiden, Primern, denaturierter DNA, einzelsträngiger zirkulärer DNA usw. ermöglicht.}

A.Gute Wiederholbarkeit: Quantifizierung in verschiedenen Qubit-Instrumenten, verschiedene Arten von Proben mit Yeasen mehrere Chargen von Cat#12645 getestet. Im Bereich von 0–200 ng gute Wiederholbarkeit bei Messungen von verschiedenen Qubit-Instrumenten.