Das HEK293 Host Cell Residual DNA Fragment Analysis Kit ist konzipiert für die quantitative Analyse von HEK293-Rest-DNA-Fragmenten verschiedener Längen in Zwischenprodukten, Halbfertigprodukten und Endprodukten biologischer Präparate. Dieses Kit nutzt das qPCR-Fluoreszenzsondenprinzip, um HEK293-DNA-Reste sowohl unter als auch über 200 Basenpaaren spezifisch und schnell zu erkennen, mit einer Quantifizierungsgrenze von nur 10 fg/μL. Es enthält auch die HEK293-DNA-Kontrolle (quantitative DNA-Referenz). Dieses Kit kann in Verbindung mit den auf magnetischen Perlen basierenden Rest-DNA-Probenvorbereitungskits des Unternehmens verwendet werden (Kat.-Nr.: 18461ES/18462ES).

Produktinformationen

Komponente

Lagerung und Versand:

1. Alle Komponenten werden auf Trockeneis versandt und sollten nach Erhalt bei -25°C bis -15°C gelagert werden. Die Haltbarkeit beträgt 2 Jahre. Die Komponenten A und B1, B2, B3 und B4 sollten lichtgeschützt gelagert werden.

2. Überprüfen Sie nach Erhalt, ob alle 7 Komponenten vorhanden sind, und lagern Sie diese umgehend bei den empfohlenen Temperaturen.

Vorsichtsmaßnahmen:

1. Dieses Produkt ist nur für Forschungszwecke bestimmt.

2. Aus Sicherheits- und Gesundheitsgründen tragen Sie während des Betriebs bitte Laborkittel und Einweghandschuhe.

3. Lesen Sie vor der Verwendung dieses Reagenzes die Gebrauchsanweisung sorgfältig durch. Experimente sollten gemäß Standardverfahren durchgeführt werden, einschließlich Probenhandhabung, Vorbereitung von Reaktionsgemischen und Pipettieren.

4. Alle Komponenten müssen durch leichtes Schütteln gründlich vermischt und vor Gebrauch kurz zentrifugiert werden.

Kompatible Instrumente:

Einschließlich, aber nicht beschränkt auf die folgenden Instrumente: Thermo Scientific: ABI 7500, ABI Quant Studio 5, ABI Step OnePlus, Bio-Rad: Optisches Modul CFX96, Shanghai Hongshi Medizintechnik: SLAN-96S

Gebrauchsanweisung

1. Verdünnung der HEK293 DNA Control Quantitative Referenz und Erstellung von Standardkurven

Das HEK293 Fragment Analysis Kit enthält vier Amplifikationsfragmente unterschiedlicher Länge: 82 bp, 133 bp, 227 bp und 515 bp. Beim Erstellen von Standardkurven erstellen Sie für jedes Amplifikationsfragment separate Kurven und berechnen deren Restmengen und relative Verteilungen basierend auf den entsprechenden Standardkurven.

Verwenden Sie den im Kit enthaltenen DNA-Verdünnungspuffer, um eine Gradientenverdünnung der HEK293 DNA Control Quantitative Reference durchzuführen. Die Verdünnungskonzentrationen sollten sein: 3 ng/μl, 300 pg/μl, 30 pg/μl, 3 pg/μl, 300 fg/μl und 30 fg/μl.

Die Einzelheiten sind wie folgt

1). Legen Sie die HEK293-DNA-Kontrolle und den DNA-Verdünnungspuffer aus dem Kit zum Auftauen auf Eis. Nach dem vollständigen Auftauen vorsichtig vortexen und kurz zentrifugieren (10 Sekunden), um die Lösung am Boden des Röhrchens zu sammeln.

2). Bereiten Sie sechs saubere 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen vor und beschriften Sie sie mit Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 und Std5.

3). Geben Sie in das mit Std0 beschriftete Röhrchen 90 μL DNA-Verdünnungspuffer und 10 μL HEK293-DNA-Kontrolle, um eine Konzentration von 3 ng/μL zu erreichen. Mischen Sie vorsichtig mit dem Vortex und zentrifugieren Sie kurz (10 Sekunden). Diese Konzentration kann aliquotiert und für den kurzfristigen Gebrauch (bis zu 3 Monate) bei -20 °C gelagert werden. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen.

4). Geben Sie in die mit Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 und Std5 beschrifteten Röhrchen zunächst jeweils 90 μL DNA-Verdünnungspuffer. Jeder Verdünnungsschritt sollte vorsichtig gemischt und kurz zentrifugiert werden, um Einheitlichkeit zu gewährleisten. Führen Sie dann einen Gradienten durch Verdünnungen wie folgt:

Tabelle 1: Standard-Gradientenverdünnung

* Führen Sie für jede Konzentration 3 Replikate durch. Dieses Reagenz kann in einem linearen Bereich von 300 pg/μL bis 30 fg/μL testen. Bei Bedarf kann der lineare Bereich entsprechend erweitert oder eingeengt werden.

** Um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu reduzieren und eine Kontamination zu vermeiden, wird empfohlen, die DNA-Quantifizierungsproben zu aliquotieren und aufzubewahren. SStandardmäßig bei -20°C für die erste Verwendung.

*** Unbenutzte, aufgetaute DNA-Verdünnungen können bei 2-8°C bis zu 7 Tage gelagert werden. Bei längerer Nichtverwendung bei -20°C lagern.

**** Um eine vollständige Durchmischung der Vorlage zu gewährleisten, schütteln Sie jede Gradientenverdünnung etwa 1 Minute lang vorsichtig.

2. Vorbereitung der Testprobe (TS)

Bereiten Sie die Testprobe TS entsprechend dem Versuchsaufbau wie folgt vor:

1) Nehmen Sie 100 μL der Testprobe und geben Sie sie in ein sauberes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Beschriften Sie es als TS, führen Sie eine Probenvorbehandlung durch und bereiten Sie dieO reinigenund die Testprobe.

2) Um die Anforderung zu erfüllen, vier verschiedene Verlängerungslängen gleichzeitig analysieren zu können, sollte die Menge der vorbehandelten Testprobe ≥120 μL betragen. Daher wird empfohlen, 2 Röhrchen jeder Probe für die Vorbehandlung vorzubereiten und diese nach der Extraktion zur Verwendung miteinander zu mischen.

3. Vorbereitung der negativen Extraktionskontrolle (NCS)

Bereiten Sie die negative Extraktionskontrolle NCS entsprechend dem Versuchsaufbau wie folgt vor:

1) Nehmen Sie 100 μL der Probenmatrixlösung (oder DNA-Verdünnung Puffer) und geben Sie es in ein sauberes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Beschriften Sie es als NCS.

2) Führen Sie die Probenvorbehandlung des negativen Kontroll-NCS zusammen mit der Testprobencharge durch und bereiten Sie die gereinigte negative Kontroll-NCS-Lösung vor.

3) Um die Anforderung zu erfüllen, vier verschiedene Verlängerungslängen gleichzeitig analysieren zu können, sollte die Menge der vorbehandelten NCS-Probe ≥120 μL betragen. Daher wird empfohlen, 2 Röhrchen jeder NCS-Probe für die Vorbehandlung vorzubereiten und diese nach der Extraktion zur Verwendung miteinander zu mischen.

4. Vorbereitung der No Template Control (NTC)

Bereiten Sie den NTC ohne Vorlage entsprechend dem Versuchsaufbau wie folgt vor:

1) No Template Control (NTC) erfordert keine Probe Vorbehandlung, und kann ab der Phase der Erkennung des Rest-DNA-Gehalts mittels qPCR vorbereitet werden.

2) Für jedes Röhrchen oder jede Vertiefung besteht die NTC-Probe aus 20 μL Mischung (d. h. 15 μL HEK293 qPCR-Mischung + 5 μL entsprechende HEK293 Primer & Probe-Mischung) + 10 μL DNA-Verdünnungspuffer. Es wird empfohlen, genug für 3 Replikationsvertiefungen vorzubereiten.

5. qPCR-Reaktionssystem

Tisch 2. Reaktionssystem für 82 bp-Fragment

Tisch 3. Reaktionssystem für 133 BP-Fragment

Tisch 4. Reaktionssystem für 227 BP-Fragment

Tisch 5. Reaktionssystem für 515 BP-Fragment

* So berechnen Sie die Gesamtmenge der für diese Reaktion erforderlichen Mischung basierend auf der Anzahl der Vertiefungen:

Mischung = (Anzahl der Reaktionsvertiefungen + 2) × (15 + 5) μL (um den Verlust der 2 Vertiefungen auszugleichen). Normalerweise werden für jede Probe 3 Replikationsvertiefungen vorbereitet.

** Anzahl der Reaktionsvertiefungen = (5 Vertiefungen mit Konzentrationsgradienten-Standardkurve + 1 No Template Control (NTC) + 1 Negative Control Solution (NCS) + N Testproben (TS)) × 3.

NTC (No Template Control): DNA-Verdünnungspuffer

NCS (Negative Control Solution): Probenmatrixlösung oder DNA-Verdünnungspuffer nach Probenvorbehandlung-Behandlung um die gereinigte Lösung zu erhalten, die das NCS ist.

TS (Testprobe): Die zu testende Probe.

***Nach dem Abgeben der Proben und Verschließen der Röhrchen kurz bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugieren (10 Sek.), um die Flüssigkeit von den Röhrchenwänden auf den Boden zu sammeln. Dann mindestens 5 Sekunden lang vortexen, um gründlich zu mischen. Anschließend erneut bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugieren (10 Sek.). Eventuelle Blasen unbedingt entfernen.

Tabelle 6: Referenzplattenlayout

Dieses Beispiel zeigens das qPCR-Erkennungsverfahren zur Analyse der Amplifikationsfragmente der restlichen HEK293-DNA.Die Testproben umfassen: 5 Konzentrationsgradienten der HEK293-DNA-Standardkurve, 1 Testprobe (TS), 1 negative Kontrolllösung (NCS) und 1 No-Template-Kontrolle (NTC). Es wird empfohlen, für jede Probe 3 Replikationsvertiefungen auszuführen.

6. Parameter des Amplifikationsprogramms (Tdrei-Schritt-Methode) (Beispiel mit ABI 7500 qPCR-Instrument, Softwareversion 2.0)**

1) Erstellen Sie ein neues leeres Programm und wählen Sie „Absolute Quantifizierung“ als Erkennungsvorlage.

2) Erstellen Sie für die vier verschiedenen Amplifikationsfragmentlängen neue Detektionssonden und nennen Sie sie „HEK293-82“, „HEK293-133“, „HEK293-227“ und „HEK293-515“. Wählen Sie als Reporter-Fluorophor „FAM“ und als Quencher-Fluorophor „kein“. Stellen Sie den Referenzfarbstoff für die Detektion auf „ROX“ ein (der Referenzfarbstoff kann je nach Instrumentenmodell und anderen Faktoren hinzugefügt werden oder nicht).

3) Legen Sie im Feld „Ziel(e) den ausgewählten Vertiefungen zuweisen“ das Feld „Aufgabe“ für die Standardkurvenvertiefungen auf „Standard“ fest und weisen Sie die entsprechenden Werte im Feld „Menge“ als „300000“, „30000“, „3000“, „300“, „30“ zu (was die DNA-Konzentration pro Vertiefung in fg/μL darstellt). Benennen Sie die Vertiefungen im Feld „Probenname“ als „300 pg/μL“, „30 pg/μL“, „3 pg/μL“, „300 fg/μL“, „30 fg/μL“. Legen Sie für die NTC-Vertiefungen die „Aufgabe“ auf „NTC“ fest. Legen Sie für die NCS- und TS-Vertiefungen die „Aufgabe“ auf „Unbekannt“ fest und benennen Sie die Vertiefungen im Feld „Probenname“ mit „NCS“ und „TS“. Nachdem Sie diese Parameter festgelegt haben, klicken Sie auf „Lauf starten“, um den Instrumentenlauf zu starten.

4) Einstellungen des Amplifikationsprogramms: Stellen Sie das dreistufige Amplifikationsprogramm mit einem Reaktionsvolumen von 30 μL ein.

Tisch7. PCR-Verfahren

7. Analyse der qPCR-Ergebnisse

1) Im Bereich „Analyse“ unter „Amplifikationsdiagramm“ legt das System automatisch den „Schwellenwert“ fest. Manchmal liegt der standardmäßige „Schwellenwert“ zu nahe an der Basislinie, was zu erheblichen Ct-Abweichungen zwischen den Replikaten führt. Sie können den „Schwellenwert“ manuell auf eine geeignete Position einstellen und auf „Analysieren“ klicken. An diesem Punkt können Sie die Amplifikationskurven im „Mehrkomponentendiagramm“ vorab überprüfen, um festzustellen, ob sie normal sind.

2) Im Bereich „Analyse“ unter „Standardkurve“ können Sie R², Amplifikationseffizienz (Eff%), Steigung und Achsenabschnitt der Standardkurve ablesen. Für eine normale Standardkurve gilt: R² > 0,99, Amplifikationseffizienz (90 % ≤ Eff% ≤ 110 %) und Steigung zwischen -3,6 und -3,1.

3) Im Bereich „Analyse“ unter „Well-Tabelle anzeigen“ können Sie die Spalte „Menge“ für die No-Template-Kontrolle (NTC), die Negativkontrolle (NCS) und die Testproben (TS) mit der Einheit in fg/μL lesen. Die Einheiten können später im Bericht umgerechnet werden.

4) Die Parametereinstellungen für die Ergebnisanalyse sollten vom jeweiligen Instrumentenmodell und der Softwareversion abhängen. Normalerweise kann das Instrument die Ergebnisse automatisch interpretieren.

5) Der Ct-Wert der Negativkontrolle (NCS) sollte größer sein als der durchschnittliche Ct-Wert der niedrigsten Konzentration der Standardkurve.

6) Das Ergebnis der No-Template-Kontrolle (NTC) sollte „Unbestimmt“ sein oder einen Ct-Wert ≥ 32 aufweisen.

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