El Centro de Evaluación de Medicamentos (CDE) de la Administración Nacional de Productos Médicos ha indicado claramente en sus directrices para productos de terapia génica que es necesario controlar la cantidad de residuos de ADN y el tamaño de los fragmentos residuales, recomendando que el tamaño de los fragmentos residuales de ADN se mantenga por debajo de los 200 pb tanto como sea posible. Por lo tanto, la eliminación de ácidos nucleicos residuales en productos biofarmacéuticos es extremadamente importante. Con la creciente complejidad de los procesos de producción, la eliminación eficaz de los ácidos nucleicos residuales en entornos con alto contenido de sal enfrenta numerosos desafíos nuevos:
- Durante el proceso de purificación de los virus AAV, para mejorar la recuperación del virus, a menudo se utilizan tampones con concentraciones de sal más altas (200-500 mM). Sin embargo, las nucleasas convencionales muestran una disminución significativa de la actividad al aumentar la concentración de sal. Si se desea mejorar el efecto de purificación aumentando la cantidad de enzima y el tiempo de incubación, aumentarán considerablemente los costos.
- El ADN del huésped suele existir en forma de cromatina y las proteínas lo encapsulan fácilmente, lo que hace que el ADN sea inaccesible. En entornos con alto contenido de sal, los ácidos nucleicos y las proteínas pueden separarse de manera eficaz, lo que permite eliminar mejor los ácidos nucleicos residuales.
- Los vectores virales como el AAV pueden agregarse debido a interacciones electrostáticas, y es más probable que esta agregación ocurra en condiciones de baja fuerza iónica y ADN residual, lo que reduce la estabilidad y afecta el rendimiento. El aumento de la concentración de sal puede reducir eficazmente la agregación de partículas del virus AAV, mejorando la tasa de recuperación de partículas del virus AAV.
La UltraNucleasa Salt Active (nucleasa de amplio espectro tolerante a la sal) es una endonucleasa no específica recombinante derivada de microorganismos marinos. En comparación con la UltraNucleasa, exhibe una actividad óptima a una concentración de sal de 500 mM y puede eliminar eficazmente la contaminación de ácidos nucleicos incluso en entornos con alto contenido de sal.
Escenarios de aplicación del producto
- Eliminación de ácidos nucleicos residuales en productos biológicos: durante la producción de productos biológicos, como virus, vacunas y proteínas, se puede añadir UltraNuclease para degradar los ácidos nucleicos residuales. Este paso no solo aumenta la producción de virus, sino que también reduce significativamente el contenido de ácidos nucleicos residuales, lo que garantiza la seguridad y la eficacia de los medicamentos.
- Reducción de la viscosidad: al degradar los ácidos nucleicos, se reduce la viscosidad de los lisados celulares, lo que facilita los procesos de filtración/ultrafiltración durante la purificación de partículas derivadas de células, como virus, vectores AAV y cuerpos de inclusión.
- Resolución y recuperación mejoradas: en análisis ELISA, electroforesis bidimensional e inmunotransferencia, mejora la resolución y la recuperación.
- Prevención de la agregación celular: UltraNuclease puede prevenir eficazmente la agregación de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC).
Pruebas de rendimiento del producto
El efecto del ambiente con alto contenido de sal sobre la actividad enzimática (Na+)
Para que coincida con el uso de Salt Active UltraNuclease, Yeasen también ha desarrollado de forma independiente un kit de detección específico para Ultranucleasa activa de sal, que puede detectar eficazmente residuos de enzimas y reducir los riesgos. El kit ELISA de ultranucleasa activa de sal se desarrolló y produjo de acuerdo con las pautas de validación de métodos analíticos <9101> de la Farmacopea china de 2020, adhiriéndose estrictamente a los requisitos clave para pruebas multiparamétricas (rango lineal, especificidad, exactitud, precisión, sensibilidad, estabilidad acelerada, etc.).
Para este fin, Yeasen Biotech ha desarrollado un kit ELISA para la detección de UltraNucleasa Activa de Sal. El kit utiliza el principio del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de sándwich de doble anticuerpo para detectar la cantidad residual de Ultranucleasa activa en presencia de sal. Las muestras estándar y de prueba de Ultranucleasa activa en presencia de sal se añaden a la placa recubierta con enzima recubierta previamente con anticuerpo anti-Ultranucleasa activa en presencia de sal (36703-A). A continuación, se añade el anticuerpo de detección de nucleasa marcado con biotina diluido (36703-C), seguido de estreptavidina-HRP (SA-HRP) (36703-D). Esto forma un complejo anticuerpo + antígeno + anticuerpo-biotina + SA-HRP. Después de lavar la placa, se añade la solución de sustrato TMB (36703-H) para el desarrollo del color. Bajo la catálisis de la enzima HRP, la TMB cambia de incolora a azul y finalmente se vuelve amarilla bajo la acción de la solución de parada (36703-I). La intensidad del color amarillo es directamente proporcional a la cantidad de nucleasa universal con alta tolerancia a la sal detectada en la muestra.
El proceso experimental de detección de UltraNucleasa Salina Activa residual utilizando el kit ELISA de UltraNucleasa Salina Activa.
Características del kit ELISA UltraNuclease y Salt Active UltraNuclease:
Cumplimiento normativo: Totalmente validado según los requisitos reglamentarios, hay informes de validación disponibles;
Seguro de calidad: Todas las materias primas para el kit se desarrollan de forma independiente, lo que garantiza una calidad controlable;
Alta sensibilidad: Límite cuantitativo tan bajo como 23 pg/mL;
Alta precisión: Alta repetibilidad intra-lote y baja variabilidad inter-lote;
Fuerte especificidad: Sin reactividad cruzada con otras proteínas celulares diseñadas
Parámetros de rendimiento
| Parámetros del producto | contenido |
| Tiempo de ensayo | 3,5 horas |
| Principio de ensayo | Ensayo inmunoenzimétrico de dos sitios |
| Amplificación de señal | Sistema biotina-estreptavidina |
| Longitud de onda de detección | 450 nm y 630 nm |
| Sensibilidad | 0,024 ng/ml |
| Rango de detección | 0.0,47 ng/ml ~ 3 ng/ml |
| Objeto de detección | Ultranucleasa activa de sal |
| Instrumento aplicable | Dispositivos moleculares: series M e i |
| Solicitud | Detección de nucleasa residual en procesos de purificación de vacunas de virus adenoasociados recombinantes y de terapia celular y génica |
Datos del producto:
Curva estándar del kit de reactivos:
Especificidad
Se evaluó la reactividad cruzada entre el anticuerpo Salt Active UltraNuclease y las siete proteínas del kit utilizando este kit para detectar las proteínas agregadas en los siete procesos. Se estableció un control positivo (PC-0,047 ng/mL) y un control negativo (NC-0 ng/mL).
Los resultados mostraron que la proteína agregada en los 7 procesos fue cercana al control negativo (NC-0 ng/mL), la concentración de detección fue menor que el límite de cuantificación de este kit (0,047 ng/mL) y no se observó reacción cruzada. observado.
STasa de recuperación del lucio:
Agregue tres estándares de concentración (es decir, Std1 3 ng/mL, Std3 0,75 ng/mL y Std5 0,188 ng/mL) en proporciones iguales a las dos muestras proporcionadas por el cliente para el experimento de recuperación de la adición. Los resultados muestran que las tasas de recuperación de la adición están todas entre el 80% y el 120%. Tasa de recuperación de la adición % = (valor medido de la muestra con adición - valor medido de la muestra sin adición) / valor teórico (cantidad de estándar añadido) * 100%.
| Nombre de muestra | Concentración de prueba de ultranucleasa activa de sal (ng/mL) | Cantidad de estándar (ng/mL) | Resultado de la prueba (ng/mL) | Tasa de recuperación de picos (%) |
| TS1 | 0,04 | 3 | 1.71 | 114,00% |
| 0,75 | 0,347 | 92,53% | ||
| 0,188 | 0,085 | 90,43% | ||
| TS2 | 0,08 | 3 | 1.772 | 118,13% |
| 0,75 | 0,405 | 108,00% | ||
| 0,188 | 0,104 | 110,64% |
Exactitud
1) Repetibilidad
Se seleccionaron tres productos estándar de UltraNucleasa Activa de Sal con concentraciones altas, medias y bajas para experimentos repetidos. En el mismo experimento, las muestras de cada concentración se analizaron 10 veces y el CV% fue < 10 %.
| Diferencia dentro del lote | |||
| Concentración teórica (ng/mL) | Número de repeticiones | Promedio (ng/mL) | Coeficiente de variación CV (%) |
| 1.5 | 10 | 1.444 | 2,97% |
| 0,188 | 10 | 0,196 | 2,27% |
| 0,047 | 10 | 0,051 | 2,56% |
2) Precisión intermedia
Se utilizaron diferentes lotes de kits para 3 experimentos, cada experimento se realizó con 3 concentraciones: alta, media y baja, y cada concentración se repitió 10 veces. Se obtuvieron un total de 30 datos de cada punto de concentración, y el CV% de cada concentración fue inferior al 15%.
| Diferencia de lote | |||
| Concentración teórica (ng/mL) | Número de experimentos | Promedio (ng/mL) | Coeficiente de variación CV (%) |
| 1.5 | 3 | 1.423 | 5,70% |
| 0,188 | 3 | 0,212 | 5,59% |
| 0,047 | 3 | 0,059 | 6,82% |
Información del producto
| Nombre del producto | Producto número | Especificaciones del producto |
| 20159ES25/50/60/80/90 | 25 KU/50 KU/100 KU/1 MU/5 MU | |
| 36703ES96 | 96T |
Otros productos relacionados
| Nombre del producto | Número de producto | Especificaciones del producto |
| 20157ES25/50/60/80/90 | 25 KU/50 KU/100 KU/1 MU/5 MU | |
| 36701ES59 | 96T |