Ces dernières années, avec le développement rapide de la biomédecine, l'émergence des thérapies cellulaires et géniques dans le cadre de la pandémie de COVID-19 et l'avènement des vaccins à ARNm, garantir la sécurité et la fiabilité des produits biologiques est devenu un point central pour les gouvernements et les organismes de réglementation du monde entier. La contamination par les mycoplasmes est un type de contamination courant mais généralement difficile à éliminer. Les exigences réglementaires imposent de « garantir l'absence de contamination par les mycoplasmes » pour les bioprocédés impliquant la culture cellulaire.
Exigences des organismes de réglementation en matière de tests de détection des mycoplasmes :
- Le document « Guidance for Industry: Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications » de la FDA stipule le contrôle des mycoplasmes pour les matières premières, les semences virales et les fluides de récolte non transformés.
- L'édition 2020 de la Pharmacopée chinoise, Partie III « Préparation et contrôle qualité des substrats de cellules animales utilisés pour les tests de production de produits biologiques » exige des tests de mycoplasmes pour les cellules de production, y compris les banques de cellules principales (MCB), les banques de cellules de travail (WCB) et les cellules de fin de production (EOPC).
- Les « Directives techniques pour la recherche pharmaceutique et l'évaluation des produits de thérapie cellulaire immunitaire (essai) » recommandent de réaliser des tests de sécurité liés aux mycoplasmes sur des échantillons intermédiaires appropriés à des moments clés ou de mettre en œuvre des mesures de contrôle pertinentes. Les tests de mycoplasmes sont également requis comme test de libération pour les produits finis.
Tests d'acides nucléiques (NAT) et méthodes traditionnelles :
Avant l'avènement des méthodes de détection rapide telles que la technologie d'amplification des acides nucléiques (NAT), les méthodes de culture traditionnelles et les tests de cellules indicatrices étaient utilisés. Cependant, en raison de cycles de détection longs ou de problèmes de sensibilité, ces méthodes prolongeaient souvent les cycles de production ou de libération ou nécessitaient une libération conditionnelle des matériaux cellulaires en fonction de l'évaluation des risques ou de l'exploration de méthodes alternatives. Avec l'avancement des thérapies cellulaires et géniques, il existe une demande croissante au sein de l'industrie pour des méthodes de détection des mycoplasmes plus rapides et plus sensibles. La courte durée de conservation des produits ne permet pas de supporter de longues périodes de test, c'est pourquoi les méthodes NAT sont apparues comme des alternatives favorables.
Actuellement, la Pharmacopée européenne (EP) <2.6.7>, la Pharmacopée japonaise (JP) et la Pharmacopée américaine (USP) <63> ont toutes inclus les méthodes NAT comme méthodes de détection des mycoplasmes. Cependant, la validation de cette méthode et la comparaison avec les méthodes traditionnelles pour garantir que sa sensibilité n'est pas inférieure sont des conditions préalables à son utilisation. Bien que l'édition 2020 de la Pharmacopée chinoise (ChP) n'ait pas inclus la NAT comme méthode de détection des mycoplasmes, elle mentionne la possibilité d'utiliser « d'autres méthodes reconnues par l'autorité nationale de réglementation des médicaments ». En mai 2022, le Drug Review Center de la National Medical Products Administration (NMPA) a publié les « Lignes directrices techniques pour la recherche pharmaceutique et l'évaluation des produits de thérapie cellulaire immunitaire (essai) », qui suggèrent d'envisager le développement de nouvelles méthodes stériles et de détection des mycoplasmes pour les tests de libération dans des circonstances particulières lorsque le volume d'échantillon est limité ou qu'une libération rapide est nécessaire et que les méthodes pharmacopéiennes sont inadéquates. Par conséquent, les méthodes NAT devraient être de plus en plus utilisées par un plus grand nombre de fournisseurs de matières premières et d’entreprises de produits médicinaux de thérapie avancée (ATMP) comme méthode capable de prendre en charge les tests de libération rapide de mycoplasmes.
Méthode NAT – Exigences de validation de la méthode
Le processus de validation des méthodes NAT est décrit en détail dans la Pharmacopée européenne <2.6.7> et la pharmacopée japonaise, leur contenu étant essentiellement cohérent. Les Instituts nationaux pour le contrôle des aliments et des médicaments (NIFDC) ont également publié un article intitulé « Considérations sur les méthodes de détection des acides nucléiques et validation méthodologique pour l'examen des mycoplasmes », visant à fournir des conseils aux développeurs et aux utilisateurs de méthodes d'amplification des acides nucléiques des mycoplasmes en Chine. La spécificité, la limite de détection et la robustesse sont essentielles pour valider les méthodes NAT des mycoplasmes. Si des kits commerciaux sont utilisés pour la détection des mycoplasmes, la validation de l'adéquation de la méthode peut être effectuée sur la base du rapport complet sur les performances du kit du fournisseur, combiné à l'environnement de laboratoire et au type d'échantillon.
Spécificité:
La spécificité fait référence à la capacité d'une méthode analytique à déterminer avec précision l'analyte en présence d'autres composants (tels que des impuretés, des produits de dégradation, des excipients, etc.). Le PE souligne la nécessité de se concentrer sur les réactions croisées entre d'autres espèces bactériennes étroitement liées à l'arbre phylogénétique, telles que Clostridium, Lactobacillus et Streptococcus au sein des bactéries Gram-positives. Une attention particulière doit également être accordée aux types de contaminants courants comme la contamination par l'ADN humain dans les cellules hôtes et les environnements expérimentaux.
Limite de détection :
La limite de détection est la plus petite quantité d'analyte qui peut être détectée dans un échantillon. Elle sert de base d'identification qualitative et n'a pas besoin d'être quantifiée comme une valeur exacte. L'EP exige 24 points de données de détection pour chaque espèce de mycoplasme à chaque concentration de dilution. Cela peut être réalisé en effectuant trois dilutions en série indépendantes de 10 fois à des jours différents, avec huit détections répétées pour chaque gradient de dilution, ou en effectuant quatre dilutions en série indépendantes de 10 fois à des jours différents, avec six détections répétées pour chaque gradient de dilution. Un taux de positivité de détection supérieur à 95 % peut être considéré comme la limite de détection. Pour les types de mycoplasmes qui nécessitent une confirmation de la limite de détection, les fabricants de kits doivent couvrir autant de types de mycoplasmes que possible, comme l'exigent les pharmacopées réglementaires, et explorer les limites de détection pour chaque type de mycoplasme. Pour les sociétés biopharmaceutiques, il est conseillé de prendre également en compte les types de mycoplasmes humains.
- Si des cellules ou des matériaux aviaires sont utilisés ou rencontrés au cours du processus de production, la vérification de la limite de détection pour Mycoplasma synoviae doit être effectuée.
- Si des insectes ou des matières végétales sont utilisés ou rencontrés au cours du processus de production, la vérification de la limite de détection pour Acholeplasma doit être effectuée.
- Le mycoplasme nasal porcin est très répandu dans les échantillons contaminés par des mycoplasmes et a attiré l’attention de l’Institut chinois de contrôle des aliments et des médicaments.
Par rapport à la Pharmacopée européenne, la Pharmacopée japonaise ne mentionne pas les mycoplasmes aviaires pour lesquels une vérification de la limite de détection est requise, mais inclut les mycoplasmes salivaires.
Robustesse :
La robustesse désigne la capacité d'une méthode à supporter de faibles variations dans les conditions de mesure sans être affectée, ce qui permet d'utiliser la méthode établie dans les tests de routine. L'évaluation de la robustesse doit se concentrer sur la tolérance des méthodes de détection des mycoplasmes aux variations de concentration de MgCl2, d'amorces et de dNTP dans les réactifs de détection, aux changements de kits d'extraction d'acides nucléiques ou d'étapes d'extraction et à l'utilisation de différents amplificateurs d'acides nucléiques.
Étude de comparabilité
Si le NAT doit être utilisé comme substitut aux méthodes pharmacopéiques, il est nécessaire de confirmer par comparaison que le NAT peut remplacer les méthodes basées sur la culture ou les méthodes de culture de cellules indicatrices.Cela implique généralement de prendre en compte la limite de détection de la méthode, ainsi que la spécificité (comme la plage de couverture des mycoplasmes et les éventuels faux positifs). Pour comparer les limites de détection, il faut répondre au critère selon lequel « une limite de détection de 10 UFC/ml peut remplacer les méthodes basées sur la culture, et une limite de détection de 100 UFC/ml peut remplacer les méthodes basées sur la culture de cellules indicatrices ».
Il existe deux approches optionnelles pour mener des études de comparabilité :
- Réalisation d'expériences synchrones en utilisant les mêmes souches de mycoplasmes validées pour les méthodes NAT et pharmacopée afin de confirmer la limite de détection.
- Comparer les résultats de la validation NAT avec les résultats de validation des méthodes pharmacopéiques précédentes, mais une documentation minutieuse des fichiers de confirmation pour les normes mycoplasmes utilisées dans les deux méthodes est nécessaire.
Détection NAT Mycoplasma qPCR - Solution complète
Produits connexes
Le kit de test qPCR Mycoplasma Yeasen MycAway™ (méthode de la sonde) est un produit de détection qualitative rapide basé sur la NAT (techniques d'amplification des acides nucléiques) pour une contamination potentielle par les mycoplasmes dans les matières premières, les banques de cellules, les semences virales, les fluides de récolte de virus ou de cellules et les cellules thérapeutiques. Ce kit, basé sur la technologie PCR quantitative, utilise des sondes de fluorescence Taqman pour détecter qualitativement l'ADN mycoplasme dans l'échantillon de test, couvrant plus de 160 séquences d'ADN mycoplasme. Il respecte strictement les directives et les exigences des normes EP 2.6.7 et JP G3 pour la détection des mycoplasmes, démontrant une sensibilité élevée, une bonne spécificité et une sécurité. Il peut être utilisé en conjonction avec le kit de prétraitement d'échantillons d'ADN résiduel à billes magnétiques MolPure® pour extraire manuellement des échantillons ou extraire automatiquement des acides nucléiques à l'aide de l'extracteur d'acide nucléique entièrement automatique Auto-Pure 32A. Après un prétraitement de l'échantillon pour éliminer les impuretés interférentes et obtenir de l'ADN mycoplasmique purifié, le signal de fluorescence de la sonde est collecté par qPCR pour déterminer le résultat de la détection.
Services techniques
- Fournir des rapports de validation complets pour le kit de test qPCR MycAway™ Mycoplasma.
- Fournir des services techniques pour la validation de l’applicabilité des échantillons clients.
- Fournir un soutien en matière d’audit.
| Description | Numéro de pièce |
| Kit de préparation d'échantillons d'ADN résiduel magnétique MolPure® | 18461ES |
| Kit de détection de mycoplasmes par qPCR MycAway™ (2G) | 40619ES |