E.coli Kit de détection des résidus d'ADN des cellules hôtes (2G)
Sommaire de la qualification (Cat. n° : 4)1308ES60)
- Arrière-plan
Les données résumées dans ce rapport sont réalisées par Yeasen Biotechnology pour le produit « E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G) ». Les données récapitulatives sont uniquement destinées à la référence de l'utilisateur, et l'utilisateur doit vérifier les résidus de cellules hôtes La méthode ADN utilisant leurs propres échantillons pour confirmer que la méthode peut répondre aux exigences de l'utilisateur. Il est recommandé à tous les laboratoires qui utilisent ce kit de vérifier les paramètres suivants : linéarité, plage, exactitude, précision, limite de quantification, spécificité et robustesse.
Yeasen Biotechnology peut fournir le rapport de qualification détaillé pour ce kit. Si l'utilisateur utilise ce rapport, seules les données d'adéquation (qui incluent la précision, Précision et spécificité) doivent être vérifiées.
- Matériel et méthodes expérimentales
2.1 Kit de détection de résidus d'ADN de cellules hôtes E.coli (2G), fournisseur : Yeasen, n° de référence : 41308ES60.
2.2 Kit de préparation d'échantillons d'ADN résiduel magnétique MolPure®, fournisseur : Yeasen, n° de référence : 18461ES60.
2.3 Norme nationale pour la teneur en ADN d'E.coli : Cat. 270027, lot n° : 201101, concentration : 96,2 μg/mL, conditions de stockage : -70℃, acheté auprès de : National Institutes for Food and Drug Control.
2.4 Données originales : la version électronique a été enregistrée dans le « Rapport expérimental » le sous-fichier du fichier parent « Kit de détection des résidus d'ADN de cellules hôtes E.coli (2G) ».
2.5 Méthodes : Les matériaux et les méthodes de fonctionnement utilisés pour l'expérience ont été essentiellement produits ou définis par Yeasen Biotechnology, qui ont été évalués et vérifiés pendant une longue période, le développement et la fabrication du kit sont suivis du système ISO 13485.
- Contenu et résultats des qualifications
3.1 Plage de détection
La plage linéaire du kit était de 30 fg/μL~300 pg/μL avec R2=1, et l'efficacité d'amplification était de 101,74 % avec un CV < 15 % pour chaque test de concentration.
Figure 1 Courbe standard de qPCR pour l'ADN d'E.coli (2G)
3.2 Précision
3.2.1 Écart par rapport à Norme nationale relative à la teneur en ADN d'E.coli
Le matériel de référence d'ADN d'E.coli de chaque lot du kit a été étalonné à l'aide de la norme nationale pour la teneur en ADN d'E.coli. Le matériel de référence d'ADN de Yeasen était pratiquement exempt de tout écart par rapport à la norme nationale pour la teneur en ADN d'E.coli courbe d'étalonnage et l'écart de la valeur d'essai était < 5 %.
3.2.2 Rrécupération
3.2.2.1 Expérience de récupération de dopage d'échantillon vierge
Des échantillons de standards d'ADN d'E.coli à des concentrations élevées et faibles : 300 pg/μL, 3 pg/μL et 30 fg/μL ont été préparés, respectivement, et analysés après extraction à l'aide de la méthode à billes magnétiques pour le kit de prétraitement d'échantillons d'ADN résiduel (2 réplicats d'extraction ont été effectués pour chaque échantillon, et 3 réplicats d'analyse ont été effectués pour chaque extraction), et les récupérations d'échantillons et les CV ont été analysés.
Pour différentes concentrations d’échantillons d’ADN, les récupérations variaient de 70 % à 130 %, et les CV étaient tous < 20 %.
| Type d'échantillon | Concentration théorique | Extrait 1 moyenne | Extrait 2 moyenne | Concentration moyenne | CV | Récupération |
| Échantillon vierge | / | / | / | / | / | / |
| Exemple de récupération 1 | 300 pg/μL | 250,56 pg/μL | 262.11 pg/μL | 256,33 pg/μL | 4,41% | 85,44% |
| Exemple de récupération 2 | 3 pg/μL | 2.29 pg/μL | 2.56 pg/μL | 2.42 pg/μL | 7,09% | 80,77% |
| Exemple de récupération 3 | 30 fg/μL | 33,62 fg/μL | 32,61 fg/μL | 33.12 fg/μL | 14,28% | 110,39% |
Tableau 1 Récupération de dopage d'échantillon vierge
3.2.2.2 Expérience de récupération d'échantillons de dopage simulés
Des échantillons de la même concentration (3 pg/μL d'ADN d'E.coli) ont été extraits (2 réplicats d'extraction ont été effectués pour chaque échantillon et 3 réplicats d'analyse ont été effectués pour chaque extraction) avec 5 solutions de fond différentes (teneur élevée en protéines, teneur élevée en acides nucléiques, pH élevé et bas, teneur élevée en sel) et les récupérations d'échantillons et les CV ont été analysés.
Les récupérations d'échantillons d'ADN pour différentes solutions de fond variaient de 70 % à 130 %, avec tous les CV < 20 %.
| Type d'échantillon | Concentration théorique | Extrait 1 moyenne | Extrait 2 moyenne | Concentration moyenne | CV | Récupération |
| Exemple de base | / | / | / | / | / | / |
| Riche en protéines | 3 pg/μL | 2.25 | 2.23 | 2.24 | 1,09% | 74,74% |
| Acide nucléaire élevé | 3.93 | 3,96 | 3,95 | 1,56% | 131,52% | |
| Teneur élevée en sel | 2.69 | 2.67 | 2.68 | 2.63 | 89,20% | |
| pH élevé | 2,90 | 3.67 | 3.29 | 13,82% | 109,55% | |
| pH faible | 2,77 | 2,87 | 2.82 | 3,41% | 94,01% |
Tableau 2 Récupération de dopage d'échantillons de base
3.3 Précision
3.3.1 Répétabilité
Répétez le test 10 fois pour les standards d'ADN d'E.coli à une concentration de 3 pg/μL avec un CV < 15 %.
| Répétitions | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Signifier | CV |
| Valeur de détection (fg/μL) | 3.16 | 2,87 | 2,97 | 2,86 | 2.81 | 2,97 | 3.14 | 3.21 | 3.14 | 3.1 | 3.02 | 4,78% |
Tableau 3 Résultats de répétabilité
3.3.2 Précision intermédiaire
Trois expérimentateurs ont testé indépendamment des échantillons standards d'ADN d'E.coli à des concentrations élevées et faibles : 300 pg/μL, 3 pg/μL et 30 fg/μL, et trois répétitions ont été effectuées pour chaque concentration, et les CV des neuf données obtenues étaient < 15 %.
| Exp |
Concentration réelle Concentration théorique | ADN d'E.coli (2G) | ||
| 300 pg/ul | 3 pg/uL | 30 fg/µL | ||
| Exp 1 | Détermination 1 | 295,65 | 3.22 | 26,90 |
| Détermination 2 | 287,71 | 3.24 | 32,00 | |
| Détermination 3 | 300.23 | 3.17 | 27,50 | |
| Exp 2 | Détermination 4 | 306.06 | 3.13 | 37.30 |
| Détermination 5 | 299,76 | 3.02 | 32,70 | |
| Détermination 6 | 299.63 | 3.02 | 34,00 | |
| Exp 3 | Détermination 7 | 266,70 | 3.01 | 35,90 |
| Détermination 8 | 272,89 | 3.09 | 40,70 | |
| Détermination 9 | 276,51 | 3.01 | 35.20 | |
| / | Signifier | 289,46 | 3.10 | 33,60 |
| / | CV | 4,89% | 3,02% | 13,18% |
Tableau 4 Résultats de précision intermédiaire
3.4 Spécificité
L'interférence de l'ADN génomique cellulaire couramment utilisé dans la production de produits biologiques a été évaluée pour l'interférence avec les réactifs de détection d'ADN d'E.coli, et le groupe d'interférence chevauchait le groupe témoin et aucune interférence n'a été observée (la figure ci-dessous montre, dans l'ordre, les données d'interférence des ADN génomiques HEK293, Vero et CHO avec les réactifs de détection d'ADN d'E.coli).
Figure 2 Résultats de l'expérience d'interférence
3.5 Limite de quantification
L'ADN d'E.coli a été détecté à 50 fg/μL, 40 fg/μL, 30 fg/μL, 10 fg/μL et 5 fg/μL, avec 10 réplicats pour chaque concentration. Les résultats ont montré que le CV était < 20 % à des concentrations de 30 fg/μL et plus. Autrement dit, la limite de quantification du kit de détection des résidus d'ADN de cellules hôtes d'E.coli (2G) était de 30 fg/μL.
|
Répétitions Élément de test | ADN d'E.coli (2G) (fg/μL) | |
| Quantité | Ratio de recalcul | |
| 1 | 29.43 | 98,09% |
| 2 | 29,51 | 98,35% |
| 3 | 32.04 | 106,79% |
| 4 | 26.07 | 86,89% |
| 5 | 34.06 | 113,53% |
| 6 | 33,54 | 111,79% |
| 7 | 26,95 | 89,82% |
| 8 | 27,38 | 91,26% |
| 9 | 27.04 | 90,13% |
| 10 | 26.10 | 87,02% |
| Signifier | 29.21 | / |
| CV | 10,40% | / |
Figure 3 Résultat du test qPCR ADN E.coli (2G) 30fg/μL
3.6 Robustesse
Ce kit a été testé et convient, sans toutefois s'y limiter, aux instruments suivants :
| Fournisseur | Modèles d'instruments | Efficacité d'amplification | R2 | Limite de quantification (fg/μL) | CV |
| Thermo | ABI 7500 | 101,74% | 1 | 30 | 13,30% |
| Thermo | ABI QuantStudio5 | 100,46% | 1 | 30 | 12,40% |
| Bio-Rad | CFX96 | 99,20% | 0,999 | 30 | 13,76% |
| Shanghai Hongshi | SLAN | 100,40% | 0,999 | 30 | 11,67% |
Tableau 5 Résultats des tests d'adéquation des instruments
3.7 Stabilité
3.7.1 Stabilité au gel-dégel
Le kit de détection des résidus d'ADN des cellules hôtes d'E.coli (2G) a été testé par congélation et décongélation répétées 10 fois, et les performances du kit n'ont pas été affectées.
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Indicateurs de test Périodes de gel et de dégel | Paramètre | Heure T0 | Geler-dégeler 10 fois |
| Paramètre de la courbe standard | Efficacité d'amplification | 98,23% | 100,20% |
| R2 | 1 | 0,999 | |
| Limite de quantification (30 fg/μL) | CV | 15,07% | 9,66% |
Tableau 6 Analyse des résultats de la stabilité au gel-dégel
3.7.2 Stabilité accélérée
E.Les résidus d'ADN des cellules hôtes du kit de détection de coli (2G) ont été stockés à 2~8°C pendant 30 jours et à 37°C pendant 14 jours, respectivement. Aucune des performances du kit n'a été affectée.
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Indicateurs de test Température et temps d'accélération | Paramètre | Expérience 1 | Expérience 2 | ||
| Heure T0 | 2~8℃ 30 Jours | Heure T0 | 37℃ 14 jours | ||
| Paramètre de la courbe standard | Efficacité d'amplification | 97,77% | 99,81% | 98,39% | 98,65% |
| R2 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Limite de quantification (30 fg/μL) | CV | 11,04% | 13,79% | 9,55% | 14,55% |
Tableau 7 Analyse accélérée des résultats de la stabilité
- 4.Référence
4.1 Commission de pharmacopée chinoise (ChPC). Pharmacopée de la République populaire de Chine (Vol Ⅲ) [S]. Pékin : China Medical Science and Technology Press, p. 542-543, 2020.
4.2 NMPA, 2007 : Principes généraux pour l'examen technique de la validation des méthodes analytiques pour le contrôle qualité des produits biologiques.
4.3 ICH(2022)《Validation de la méthode analytique Q2》, version préliminaire.
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