Le Centre d'évaluation des médicaments (CDE) de la National Medical Products Administration a clairement indiqué dans ses directives relatives aux produits de thérapie génique qu'il est nécessaire de contrôler la quantité de résidus d'ADN et la taille des fragments résiduels, recommandant que la taille des fragments résiduels d'ADN soit contrôlée autant que possible en dessous de 200 pb. Par conséquent, l'élimination des acides nucléiques résiduels dans les produits biopharmaceutiques est extrêmement importante. Avec la complexité croissante des processus de production, l'élimination efficace des acides nucléiques résiduels dans les environnements à forte teneur en sel est confrontée à de nombreux nouveaux défis :
- Lors du processus de purification des virus AAV, des tampons avec des concentrations de sel plus élevées (200-500 mM) sont souvent utilisés pour améliorer la récupération du virus. Cependant, les nucléases conventionnelles présentent une diminution significative de l'activité avec l'augmentation de la concentration de sel. Si l'effet de purification doit être amélioré en augmentant la quantité d'enzyme et le temps d'incubation, cela augmentera considérablement les coûts
- L'ADN de l'hôte existe généralement sous forme de chromatine et est facilement encapsulé par des protéines, ce qui le rend inaccessible. Dans les environnements à forte teneur en sel, les acides nucléiques et les protéines peuvent se séparer efficacement, ce qui permet d'éliminer plus efficacement les acides nucléiques résiduels
- Les vecteurs viraux tels que l'AAV peuvent s'agréger en raison d'interactions électrostatiques, et cette agrégation est plus susceptible de se produire dans des conditions de faible force ionique et d'ADN résiduel, ce qui entraîne une réduction de la stabilité et affecte le rendement. L'augmentation de la concentration en sel peut réduire efficacement l'agrégation des particules virales AAV, améliorant ainsi le taux de récupération des particules virales AAV
L'UltraNuclease à large spectre tolérante au sel (Salt Active UltraNuclease) est une endonucléase non spécifique recombinante dérivée de micro-organismes marins. Par rapport à l'UltraNuclease, elle présente une activité optimale à une concentration de sel de 500 mM et peut éliminer efficacement la contamination par les acides nucléiques même dans des environnements à forte teneur en sel.
Scénarios d'application de produits
- Élimination des acides nucléiques résiduels dans les produits biologiques : lors de la production de produits biologiques, tels que les virus, les vaccins et les protéines, l'UltraNuclease peut être ajoutée pour dégrader les acides nucléiques résiduels. Cette étape permet non seulement d'augmenter le rendement des virus, mais aussi de réduire considérablement la teneur en acides nucléiques résiduels, garantissant ainsi la sécurité et l'efficacité des médicaments.
- Réduction de la viscosité : En dégradant les acides nucléiques, la viscosité des lysats cellulaires est réduite, ce qui facilite les processus de filtration/ultrafiltration lors de la purification de particules dérivées de cellules telles que les virus, les vecteurs AAV et les corps d'inclusion.
- Résolution et récupération améliorées : dans les analyses ELISA, électrophorèse bidimensionnelle et immunoblot, il améliore la résolution et la récupération.
- Prévention de l’agrégation cellulaire : UltraNuclease peut prévenir efficacement l’agrégation des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC).
Tests de performance des produits
L'effet d'un environnement riche en sel sur l'activité enzymatique (Na+)
Pour correspondre à l'utilisation de Salt Active UltraNuclease, Yeasen a également développé indépendamment un kit de détection spécifique pour UltraNuclease active au sel, qui peut détecter efficacement les résidus d'enzymes et réduire les risques. Le kit ELISA Salt Active UltraNuclease a été développé et produit conformément aux directives de validation des méthodes analytiques <9101> de la pharmacopée chinoise 2020, en respectant strictement les exigences clés des tests multiparamétriques (plage linéaire, spécificité, exactitude, précision, sensibilité, stabilité accélérée, etc.).
À cet effet, Yeasen Biotech a développé un kit ELISA pour la détection de l'UltraNuclease active au sel. Le kit utilise le principe du test immuno-enzymatique en sandwich à double anticorps (ELISA) pour détecter la quantité résiduelle de UltraNuclease active au sel. Les échantillons standard et test d'UltraNuclease active au sel sont ajoutés à la plaque enduite d'enzyme pré-enduite d'anticorps anti-UltraNuclease active au sel (36703-A). Ensuite, l'anticorps de détection de nucléase marqué à la biotine dilué (36703-C) est ajouté, suivi de la streptavidine-HRP (SA-HRP) (36703-D). Cela forme un complexe anticorps + antigène + anticorps-biotine + SA-HRP. Après lavage de la plaque, une solution de substrat TMB (36703-H) est ajoutée pour le développement de la couleur. Sous la catalyse de l'enzyme HRP, le TMB passe de l'incolore au bleu et devient finalement jaune sous l'action de la solution d'arrêt (36703-I). L'intensité de la couleur jaune est directement proportionnelle à la quantité de nucléase universelle à haute tolérance au sel détectée dans l'échantillon.
Processus expérimental de détection de l'UltraNuclease résiduelle à activité saline à l'aide du kit ELISA Salt Active UltraNuclease.
Caractéristiques du kit ELISA UltraNuclease et Salt Active UltraNuclease :
Conformité réglementaire : Entièrement validés selon les exigences réglementaires, des rapports de validation sont disponibles ;
Assurance qualité: Toutes les matières premières du kit sont développées indépendamment, garantissant une qualité contrôlable ;
Haute sensibilité : Limite quantitative aussi basse que 23 pg/mL ;
Haute précision : Répétabilité intra-lot élevée et faible variabilité inter-lots ;
Forte spécificité : Aucune réactivité croisée avec d’autres protéines cellulaires modifiées
Paramètres de performance
| Paramètres du produit | contenu |
| Temps d'analyse | 3,5 heures |
| Principe de l'essai | Dosage immunoenzymatique à deux sites |
| Amplification du signal | Système biotine-streptavidine |
| Longueur d'onde de détection | 450 nm et 630 nm |
| Sensibilité | 0,024 ng/ml |
| Plage de détection | 0.0,47 ng/ml à 3 ng/ml |
| Objet de détection | UltraNuclease active au sel |
| Instrument applicable | Dispositifs moléculaires : Séries M et i |
| Application | Détection de nucléase résiduelle dans les processus de purification de thérapie cellulaire et génique et de vaccins à virus adéno-associés recombinants |
Données du produit :
Courbe standard du kit de réactifs :
Spécificité
La réactivité croisée entre l'anticorps Salt Active UltraNuclease et les sept protéines du kit a été évaluée en utilisant ce kit pour détecter les protéines ajoutées dans les sept processus. Un contrôle positif (PC-0,047 ng/mL) et un contrôle négatif (NC-0 ng/mL) ont été mis en place.
Les résultats ont montré que la protéine ajoutée dans les 7 processus était proche du contrôle négatif (NC-0 ng/mL), la concentration de détection était inférieure à la limite de quantification de ce kit (0,047 ng/mL) et aucune réaction croisée n'a été observée. observé.
Sbrochet Taux de récupération :
Ajoutez trois étalons de concentration (c.-à-d., Std1 3 ng/mL, Std3 0,75 ng/mL et Std5 0,188 ng/mL) dans des proportions égales aux deux échantillons fournis par le client pour l'expérience de récupération des pointes. Les résultats montrent que les taux de récupération des pointes sont tous compris entre 80 % et 120 %. Taux de récupération des pointes % = (valeur mesurée de l'échantillon dopé - valeur mesurée de l'échantillon non dopé) / valeur théorique (quantité d'étalon ajoutée) * 100 %.
| Nom de l'échantillon | Concentration d'essai de l'UltraNuclease active au sel (ng/mL) | Quantité de standard (ng/mL) | Résultat du test (ng/mL) | Taux de récupération des pics (%) |
| TS1 | 0,04 | 3 | 1.71 | 114,00% |
| 0,75 | 0,347 | 92,53% | ||
| 0,188 | 0,085 | 90,43% | ||
| TS2 | 0,08 | 3 | 1.772 | 118,13% |
| 0,75 | 0,405 | 108,00% | ||
| 0,188 | 0,104 | 110,64% |
Précision
1) Répétabilité
Trois produits standards UltraNuclease à haute, moyenne et faible concentration ont été sélectionnés pour des expériences répétées. Dans la même expérience, les échantillons de chaque concentration ont été testés 10 fois et le CV% < 10 %.
| Différence entre les lots | |||
| Concentration théorique (ng/mL) | Nombre de répétitions | Moyenne (ng/mL) | Coefficient de variation CV (%) |
| 1,5 | 10 | 1.444 | 2,97% |
| 0,188 | 10 | 0,196 | 2,27% |
| 0,047 | 10 | 0,051 | 2,56% |
2) Précision intermédiaire
Différents lots de kits ont été utilisés pour 3 expériences, chaque expérience a été réalisée avec 3 concentrations élevées, moyennes et faibles, et chaque concentration a été répétée 10 fois. Au total, 30 données ont été obtenues à partir de chaque point de concentration, et le CV% de chaque concentration était inférieur à 15 %.
| Différence de lot | |||
| Concentration théorique (ng/mL) | Nombre d'expériences | Moyenne (ng/mL) | Coefficient de variation CV (%) |
| 1,5 | 3 | 1.423 | 5,70% |
| 0,188 | 3 | 0,212 | 5,59% |
| 0,047 | 3 | 0,059 | 6,82% |
Informations sur le produit
| Nom du produit | Produit nombre | Spécifications du produit |
| 20159ES25/50/60/80/90 | 25KU/50KU/100KU/1MU/5MU | |
| 36703ES96 | 96T |
Autres produits connexes
| Nom du produit | Numéro de produit | Spécifications du produit |
| 20157ES25/50/60/80/90 | 25KU/50KU/100KU/1MU/5MU | |
| 36701ES59 | 96T |