माइकोप्लाज्मा QPCR का पता लगाने और विधि सत्यापन सेल और जीन थेरेपी प्रौद्योगिकी विकास की उन्नति में योगदान देता है

हाल के वर्षों में, बायोमेडिसिन के तेजी से विकास, कोविड-19 महामारी के तहत सेल और जीन थेरेपी के उद्भव और mRNA टीकों के आगमन के साथ, जैविक उत्पादों की सुरक्षा और विश्वसनीयता सुनिश्चित करना दुनिया भर की सरकारों और नियामक निकायों के लिए एक केंद्र बिंदु बन गया है। माइकोप्लाज्मा संदूषण एक आम लेकिन आम तौर पर चुनौतीपूर्ण प्रकार का संदूषण है जिसे खत्म करना मुश्किल है। नियामक आवश्यकताओं में सेल कल्चर से जुड़े बायोप्रोसेस के लिए "माइकोप्लाज्मा संदूषण न होने की गारंटी" अनिवार्य है।

माइकोप्लाज्मा परीक्षण के लिए नियामक एजेंसियों की आवश्यकताएँ:

• FDA के "उद्योग के लिए मार्गदर्शन: संक्रामक रोग संकेतों के लिए वायरल टीकों के उत्पादन में प्रयुक्त सेल सब्सट्रेट और अन्य जैविक सामग्रियों का लक्षण वर्णन और योग्यता" में कच्चे माल, वायरल बीजों और अप्रसंस्कृत फसल तरल पदार्थों के लिए माइकोप्लाज्मा नियंत्रण का प्रावधान किया गया है।
• चीनी फार्माकोपिया भाग III "जैविक उत्पाद उत्पादन परीक्षण के लिए प्रयुक्त पशु कोशिका सब्सट्रेट की तैयारी और गुणवत्ता नियंत्रण" के 2020 संस्करण में मास्टर सेल बैंक (MCB), वर्किंग सेल बैंक (WCB), और एंड-ऑफ-प्रोडक्शन सेल (EOPC) सहित उत्पादन कोशिकाओं के लिए माइकोप्लाज्मा परीक्षण की आवश्यकता है।
• "इम्यून सेल थेरेपी उत्पादों (परीक्षण) के फार्मास्युटिकल अनुसंधान और मूल्यांकन के लिए तकनीकी दिशानिर्देश" मुख्य समय बिंदुओं पर उपयुक्त मध्यवर्ती नमूनों पर माइकोप्लाज्मा सुरक्षा-संबंधी परीक्षण करने या नियंत्रण के लिए प्रासंगिक उपायों को लागू करने की सलाह देते हैं। अंतिम उत्पादों के लिए रिलीज़ परीक्षण के रूप में माइकोप्लाज्मा परीक्षण भी आवश्यक है।

न्यूक्लिक एसिड परीक्षण (NAT) और पारंपरिक विधियाँ:

न्यूक्लिक एसिड एम्पलीफिकेशन टेक्नोलॉजी (NAT) जैसे त्वरित पहचान विधियों के आगमन से पहले, पारंपरिक संस्कृति विधियाँ और संकेतक सेल परख का उपयोग किया जाता था। हालाँकि, लंबे समय तक पहचान चक्र या संवेदनशीलता के मुद्दों के कारण, ये विधियाँ अक्सर उत्पादन या रिलीज़ चक्र को लम्बा खींच देती थीं या जोखिम मूल्यांकन या वैकल्पिक विधियों की खोज के आधार पर सेल सामग्री की सशर्त रिलीज़ की आवश्यकता होती थी। सेल और जीन थेरेपी की उन्नति के साथ, उद्योग के भीतर अधिक समयबद्धता और संवेदनशीलता के साथ माइकोप्लाज्मा पहचान विधियों की मांग बढ़ रही है। उत्पादों का छोटा शेल्फ जीवन लंबी परीक्षण अवधि को बनाए नहीं रख सकता है, इसलिए NAT विधियाँ अनुकूल विकल्प के रूप में उभरी हैं।

वर्तमान में, यूरोपीय फार्माकोपिया (EP) <2.6.7>, जापानी फार्माकोपिया (JP), और यूनाइटेड स्टेट्स फार्माकोपिया (USP) <63> सभी ने माइकोप्लाज्मा का पता लगाने के तरीकों के रूप में NAT विधियों को शामिल किया है। हालाँकि, इस विधि का सत्यापन और इसकी संवेदनशीलता कम नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए पारंपरिक तरीकों से तुलना इसके उपयोग के लिए आवश्यक शर्तें हैं। हालाँकि चीनी फार्माकोपिया (ChP) के 2020 संस्करण ने माइकोप्लाज्मा का पता लगाने के तरीके के रूप में NAT को शामिल नहीं किया है, लेकिन इसमें "राष्ट्रीय दवा नियामक प्राधिकरण द्वारा मान्यता प्राप्त अन्य तरीकों" का उपयोग करने की संभावना का उल्लेख है। मई 2022 में, नेशनल मेडिकल प्रोडक्ट्स एडमिनिस्ट्रेशन (NMPA) के ड्रग रिव्यू सेंटर ने "इम्यून सेल थेरेपी प्रोडक्ट्स (ट्रायल) के फार्मास्युटिकल रिसर्च और मूल्यांकन के लिए तकनीकी दिशानिर्देश" जारी किए, जो विशेष परिस्थितियों में रिलीज़ परीक्षण के लिए नए बाँझ और माइकोप्लाज्मा का पता लगाने के तरीकों के विकास पर विचार करने का सुझाव देते हैं जब नमूना मात्रा सीमित होती है या तेजी से रिलीज़ की आवश्यकता होती है और फार्माकोपियल तरीके अपर्याप्त होते हैं। इसलिए, यह आशा की जा रही है कि NAT पद्धति का उपयोग अधिकाधिक कच्चे माल के आपूर्तिकर्ताओं और उन्नत चिकित्सा औषधीय उत्पाद (ATMP) कंपनियों द्वारा तेजी से माइकोप्लाज्मा रिलीज परीक्षण में सहायता करने वाली पद्धति के रूप में किया जाएगा।

NAT विधि - विधि सत्यापन आवश्यकताएँ

NAT विधियों के लिए सत्यापन प्रक्रिया का विस्तृत वर्णन यूरोपीय फार्माकोपिया <2.6 में किया गया है।7> और जापानी फार्माकोपिया, जिनकी सामग्री अनिवार्य रूप से सुसंगत है। नेशनल इंस्टीट्यूट्स फॉर फूड एंड ड्रग कंट्रोल (NIFDC) ने भी माइकोप्लाज्मा जांच के लिए न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन विधियों और पद्धतिगत सत्यापन पर विचार शीर्षक से एक लेख प्रकाशित किया है, जिसका उद्देश्य चीन में माइकोप्लाज्मा न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन विधियों के डेवलपर्स और उपयोगकर्ताओं के लिए मार्गदर्शन प्रदान करना है। माइकोप्लाज्मा NAT विधियों को मान्य करने के लिए विशिष्टता, पता लगाने की सीमा और मजबूती आवश्यक है। यदि माइकोप्लाज्मा का पता लगाने के लिए वाणिज्यिक किट का उपयोग किया जाता है, तो विधि उपयुक्तता सत्यापन आपूर्तिकर्ता की व्यापक किट प्रदर्शन रिपोर्ट के आधार पर किया जा सकता है, प्रयोगशाला वातावरण और नमूना प्रकार के साथ संयुक्त।

सत्यापन रिपोर्ट

विशिष्टता:

विशिष्टता का तात्पर्य किसी विश्लेषणात्मक विधि की अन्य घटकों (जैसे अशुद्धियाँ, अपघटन उत्पाद, एक्सिपिएंट्स, आदि) की उपस्थिति में विश्लेषक को सटीक रूप से निर्धारित करने की क्षमता से है। ईपी अन्य जीवाणु प्रजातियों के बीच क्रॉस-रिएक्शन पर ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता पर जोर देता है जो कि ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया के भीतर क्लोस्ट्रीडियम, लैक्टोबैसिलस और स्ट्रेप्टोकोकस जैसे फ़ाइलोजेनेटिक पेड़ से निकटता से संबंधित हैं। मेजबान कोशिकाओं और प्रयोगात्मक वातावरण में मानव डीएनए संदूषण जैसे सामान्य संदूषक प्रकारों पर भी ध्यान दिया जाना चाहिए।

पता करने की सीमा:

पता लगाने की सीमा विश्लेषक की वह न्यूनतम मात्रा है जिसे किसी नमूने में पता लगाया जा सकता है। यह गुणात्मक पहचान के आधार के रूप में कार्य करता है और इसे सटीक मान के रूप में परिमाणित करने की आवश्यकता नहीं होती है। EP को प्रत्येक तनुकरण सांद्रता पर प्रत्येक माइकोप्लाज्मा प्रजाति के लिए 24 पता लगाने वाले डेटा बिंदुओं की आवश्यकता होती है। इसे अलग-अलग दिनों में तीन स्वतंत्र 10-गुना क्रमिक तनुकरण करके, प्रत्येक तनुकरण ढाल के लिए आठ बार दोहराए गए पता लगाने के साथ, या अलग-अलग दिनों में चार स्वतंत्र 10-गुना क्रमिक तनुकरण करके, प्रत्येक तनुकरण ढाल के लिए छह बार दोहराए गए पता लगाने के साथ प्राप्त किया जा सकता है। 95% से अधिक की पहचान सकारात्मकता दर को पता लगाने की सीमा के रूप में माना जा सकता है। माइकोप्लाज्मा प्रकारों के लिए जिन्हें पता लगाने की सीमा की पुष्टि की आवश्यकता होती है, किट निर्माताओं को विनियामक फार्माकोपिया द्वारा आवश्यक रूप से अधिक से अधिक माइकोप्लाज्मा प्रकारों को कवर करने और प्रत्येक माइकोप्लाज्मा प्रकार के लिए पता लगाने की सीमाओं का पता लगाने की आवश्यकता होती है। बायोफार्मास्युटिकल कंपनियों के लिए, मानव माइकोप्लाज्मा प्रकारों पर भी विचार करना उचित है।

• यदि उत्पादन प्रक्रिया के दौरान एवियन कोशिकाओं या सामग्रियों का उपयोग किया जाता है या उनका सामना होता है, तो माइकोप्लाज्मा सिनोविया के लिए पता लगाने की सीमा का सत्यापन किया जाना चाहिए।
• यदि उत्पादन प्रक्रिया के दौरान कीट या पौधों की सामग्री का उपयोग किया जाता है या उनका सामना होता है, तो एकोलेप्लाज्मा के लिए पता लगाने की सीमा का सत्यापन किया जाना चाहिए।
• माइकोप्लाज्मा-दूषित नमूनों में पोर्सिन नेज़ल माइकोप्लाज्मा अत्यधिक प्रचलित है और इसने चीन के खाद्य एवं औषधि नियंत्रण संस्थान का ध्यान आकर्षित किया है।

यूरोपीय फार्माकोपिया की तुलना में, जापानी फार्माकोपिया में एवियन माइकोप्लाज्मा का उल्लेख नहीं है जिसके लिए पता लगाने की सीमा का सत्यापन आवश्यक है, लेकिन इसमें लार संबंधी माइकोप्लाज्मा शामिल है।

मजबूती:

मजबूती से तात्पर्य मापन स्थितियों में छोटे बदलावों को बिना प्रभावित हुए झेलने की विधि की क्षमता से है, जो नियमित परीक्षण में स्थापित विधि के उपयोग के लिए आधार प्रदान करता है। मजबूती का मूल्यांकन माइकोप्लाज्मा पहचान विधियों की MgCl2, प्राइमर्स और dNTPs की सांद्रता में भिन्नताओं, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण किट या निष्कर्षण चरणों में परिवर्तन और विभिन्न न्यूक्लिक एसिड एम्पलीफायरों के उपयोग के प्रति सहनशीलता पर केंद्रित होना चाहिए।

तुलनात्मक अध्ययन

यदि NAT को फार्माकोपियाल विधियों के विकल्प के रूप में उपयोग किया जाना है, तो तुलना के माध्यम से यह पुष्टि करना आवश्यक है कि NAT संवर्धन-आधारित विधियों या सूचक कोशिका संवर्धन विधियों का स्थान ले सकता है।इसमें आमतौर पर विधि की पहचान सीमा, साथ ही विशिष्टता (जैसे माइकोप्लाज्मा कवरेज की सीमा और संभावित गलत सकारात्मक) पर विचार करना शामिल है। पहचान सीमाओं की तुलना करने के लिए, इसे इस मानदंड को पूरा करना चाहिए कि "10 CFU/mL की पहचान सीमा संस्कृति-आधारित विधियों को प्रतिस्थापित कर सकती है, और 100 CFU/mL की पहचान सीमा संकेतक सेल संस्कृति विधियों को प्रतिस्थापित कर सकती है।"

तुलनात्मक अध्ययन करने के लिए दो वैकल्पिक दृष्टिकोण हैं:

1. पता लगाने की सीमा की पुष्टि करने के लिए NAT और फार्माकोपियाल दोनों विधियों के लिए समान मान्य माइकोप्लाज्मा उपभेदों का उपयोग करके समकालिक प्रयोगों का संचालन करना।
2. NAT सत्यापन के परिणामों की तुलना पिछले फार्माकोपियल विधि सत्यापन परिणामों से की जानी चाहिए, लेकिन दोनों विधियों में प्रयुक्त माइकोप्लाज्मा मानकों के लिए पुष्टिकरण फाइलों का सावधानीपूर्वक दस्तावेजीकरण आवश्यक है।

NAT माइकोप्लाज्मा qPCR जांच - व्यापक समाधान

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तकनीकी सेवाएँ

1. MycAway™ माइकोप्लाज्मा qPCR टेस्ट किट के लिए व्यापक सत्यापन रिपोर्ट प्रदान करना।
2. ग्राहक नमूना प्रयोज्यता सत्यापन के लिए तकनीकी सेवाएं प्रदान करना।
3. लेखापरीक्षा सहायता प्रदान करना।

विवरण	भाग संख्या
MolPure® चुंबकीय अवशिष्ट डीएनए नमूना तैयारी किट	18461ईएस
MycAway™ माइकोप्लाज्मा qPCR डिटेक्शन किट (2जी)	40619ईएस