HEK293 Kit Deteksi Residu DNA Sel Inang (3G)
Ringkasan Kualifikasi (Nomor Kategori: 4)tahun 1331Bahasa Inggris ES60
- Latar belakang
Data yang dirangkum dalam laporan ini dilakukan oleh
- Bahan dan metode percobaan
2.1 HEK293 Kit Deteksi Residu DNA Sel Inang (3G), Vendor:
2.2 Kit Persiapan Sampel DNA Residu Magnetik MolPure®, Vendor:
2.3 Data asli: versi elektronik dicatat dalam 'Laporan Eksperimen' subfile dari file induk 'HEK293 Kit Deteksi Residu DNA Sel Inang (3G)'.
2.4 Metode: Bahan dan metode operasi yang digunakan untuk percobaan pada dasarnya diproduksi atau ditetapkan oleh
- Isi dan hasil kualifikasi
3.1 Jangkauan deteksi
Kisaran linier kit adalah 30 fg/μL~300 pg/μL dengan R2≥0,998, dan efisiensi amplifikasi berada pada kisaran 90%~110% dengan CV<15% untuk setiap uji konsentrasi.
Gambar 1 Kurva Standar qPCR DNA HEK293 (3G)
3.2 Akurasi
3.2.1 Rlingkungan
3.2.1.1 Percobaan Pemulihan Spiking Sampel Kosong
Sampel HEK293 Standar DNA pada konsentrasi tinggi dan rendah: 300 pg/μL, 3 pg/μL, dan 30 fg/μL masing-masing disiapkan, dan diuji setelah ekstraksi menggunakan Metode Manik Magnetik untuk Kit Pra-perlakuan Sampel DNA Residu (2 replikasi ekstraksi dilakukan untuk setiap sampel, dan 3 replikasi pengujian dilakukan untuk setiap ekstraksi), dan pemulihan sampel dan CV dianalisis.
Untuk berbagai konsentrasi sampel DNA, pemulihan berkisar antara 70% hingga 130%, dan CV semuanya <20%.
| Jenis sampel | Konsentrasi Teoritis | Ekstrak 1 rata-rata | Ekstrak 2 rata-rata | Konsentrasi rata-rata | Riwayat Hidup | Pemulihan |
| Sampel Kosong | / | / | / | / | / | / |
| Sampel pemulihan 1 | 300 pg/μL | 306.81 pg/μL | 279.57 pg/μL | 293.82 pg/μL | 6,56% | 97,94% |
| Sampel pemulihan 2 | 3 pg/μL | 3.11 pg/μL | 2,99 pg/μL | 3.09 pg/μL | 2,75% | 103,00% |
| Sampel pemulihan 3 | 30 fg/μL | Tanggal 31.02 fg/μL | 30.63 fg/μL | 30.83 fg/μL | 0,89% | 102,77% |
Tabel 1 Pemulihan Spiking Sampel Kosong
3.2.1.2 Simulasi Percobaan Pemulihan Spiking Sampel
Sampel dengan konsentrasi yang sama (3 pg/μL DNA HEK293) diekstraksi (2 replikasi ekstraksi dilakukan untuk setiap sampel dan 3 replikasi pengujian dilakukan untuk setiap ekstraksi) dengan 5 larutan latar belakang yang berbeda (protein tinggi, asam nukleat tinggi, pH tinggi dan rendah, garam tinggi) dan pemulihan sampel dan CV dianalisis.
Pemulihan sampel DNA untuk berbagai larutan latar belakang berkisar antara 70% hingga 130%, dengan semua CV <20%.
| Jenis sampel | Konsentrasi Teoritis | Ekstrak 1 rata-rata | Ekstrak 2 rata-rata | Konsentrasi rata-rata | Riwayat Hidup | Pemulihan |
| Sampel Dasar | / | / | / | / | / | / |
| Protein Tinggi | 3 pg/μL | 2.65 | 2.80 | 2.73 | 3,80% | 90,87% |
| Asam Nuklir Tinggi | 2.82 | 2.97 | 2.90 | 3,71% | 96,58% | |
| kadar garam tinggi | 2.88 | 2.70 | 2.79 | 4,47% | 92,89% | |
| pH tinggi | 2.81 | 2.93 | 2.87 | 2,98% | 95,71% | |
| pH rendah | 2.76 | 2.79 | 2.77 | 0,99% | 92,48% |
Tabel 2 Pemulihan Spiking Sampel Dasar
3.3 Presisi
3.3.1 Kemampuan mengulang
Ulangi pengujian 10 kali untuk standar DNA HEK293 pada konsentrasi 30 fg/μL dengan CV <15%.
| Pengulangan | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Berarti | CV% |
| Nilai Deteksi (fg/μL) | 29.51 | Tanggal 30.02 | 30.13 | 30.16 | 27.99 | Tanggal 31.01 | Tanggal 31.05 | 30.95 | Tanggal 31.02 | 29.86 | 30.17 | 3,15% dari |
Tabel 3 Hasil Pengulangan
3.3.2 Presisi menengah
Tiga peneliti secara independen menguji sampel standar DNA HEK293 pada konsentrasi tinggi dan rendah: 300 pg/μL, 3 pg/μL, dan 30 fg/μL, dan tiga replikasi dilakukan untuk setiap konsentrasi, dan CV dari kesembilan data yang diperoleh adalah <15%.
| Eksp |
Konsentrasi Aktual Konsentrasi Teoritis | DNA HEK293 (3G) | ||
| 300 pg/l | 3 pg/l | 30 fg/l dosis tunggal | ||
| Eksp 1 | Penentuan 1 | 319.58 | 3.026 | tanggal 32.02 |
| Penentuan 2 | 309.76 | 3.051 | 37.01 | |
| Penentuan 3 | 309.24 | 3.067 | 36.03 | |
| Eksp 2 | Penentuan 4 | 308.34 | 2.909 | 29.91 |
| Penentuan 5 | 308.54 | 2.9 | 29.67 | |
| Penentuan 6 | 305.83 | 2.921 | Nomor telepon 28.85 | |
| Eksp 3 | Penentuan 7 | Nomor 299.11 | 3.035 | 29.36 |
| Penentuan 8 | 300.07 | 2.833 | 31.14 | |
| Penentuan 9 | 302.03 | 3.033 | Tanggal 33.07 | |
| / | Berarti | 306.95 | 2.975 | 31.90 |
| / | CV% | 2,03% | 2,83% | 9,26% |
Tabel 4 Presisi Menengah Hasil
3.4 Spesifisitas
Interferensi DNA genomik seluler yang umum digunakan dalam produksi biologik dinilai untuk interferensi dengan reagen deteksi DNA HEK293, dan kelompok interferensi tumpang tindih dengan kelompok kontrol dan tidak ada interferensi yang terlihat (gambar di bawah ini menunjukkan, secara berurutan, data interferensi DNA genomik CHO, E.coli, dan Pichia Pastoris dengan reagen deteksi DNA HEK293).
Gambar 2 Hasil percobaan interferensi
3.5 Batasan Kuantisasi
DNA HEK293 terdeteksi pada 30 fg/μL, 20 fg/μL, 10 fg/μL dan 5 fg/μL, dengan 10 kali ulangan untuk setiap konsentrasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa CV <20% pada konsentrasi 10 fg/μL dan di atasnya. Artinya, batas kuantifikasi kit deteksi residu DNA sel inang HEK293 (3G) adalah 10 fg/μL.
|
Pengulangan Item Uji | DNA HEK293 (3G) (fg/μL) | |
| Kuantitas | Rasio Perhitungan Ulang% | |
| 1 | tanggal 11.04 | 110,40% |
| 2 | 9.97 | 99,70% |
| 3 | Tanggal 11.12 | 111,20% |
| 4 | tanggal 11.07 | 110,70% |
| 5 | Tanggal 11.21 | 112,10% |
| 6 | 9.93 | 99,30% |
| 7 | 10.25 | 102,50% |
| 8 | 10.16 | 101,60% |
| 9 | Tanggal 10.08 | 100,80% |
| 10 | Tanggal 10.11 | 101,10% |
| Berarti | 10.49 | / |
| CV% | 5,14% | / |
Gambar 3 Hasil Uji qPCR DNA HEK293 10fg/μL (3G)
3.6 Ketahanan
Kit ini telah diuji dan cocok untuk, namun tidak terbatas pada, instrumen berikut:
| Penjual | Model Instrumen | Efisiensi Amplifikasi | R2 | Batas kuantifikasi (fg/μL) | CV% |
| Termo | ABI 7500 | 102,84% | 1 | 10 | 7% |
| Termo | Studio Kuantitatif ABI 5 | 104,70% | 0,999 | 10 | 9% |
| Shanghai Hongshi | Bahasa SLAN | 101,46% | 0,999 | 10 | 8% |
Tabel 5 Hasil Uji Kesesuaian Instrumen
3.7 Stabilitas
3.7.1 Stabilitas beku-cair
Kit Deteksi Residu DNA Sel Inang HEK293 (3G) diuji dengan pembekuan dan pencairan berulang sebanyak 10 kali, dan kinerja kit tidak terpengaruh.
|
Menguji Indikator Waktu Beku-Cair | Parameter | Waktu T0 | Bekukan-cairkan 10 kali |
| Parameter Kurva Standar | Efisiensi Amplifikasi | 99,34% | 100,78% |
| R2 | 1 | 1 | |
| Batas kuantifikasi (30 fg/μL) | Riwayat Hidup | 11% | 7% |
Tabel 6 Analisis hasil stabilitas beku-cair
3.7.2 Stabilitas yang Dipercepat
Kit Deteksi Residu DNA Sel Inang HEK293 (3G) disimpan pada suhu 2~8°C selama 30 hari dan 37°C selama 14 hari. Tidak ada kinerja kit yang terpengaruh.
|
Menguji Indikator Suhu dan Waktu Akselerasi | Parameter | Waktu T0 | 37℃ 7 Hari | 37℃ 14 Hari |
| Parameter Kurva Standar | Efisiensi Amplifikasi | 103,83% | 101,58% | 100,47% |
| R2 | 0,999 | 1 | 1 | |
| Batas kuantifikasi (30 fg/μL) | CV% | 8% | 5% | 5% |
Tabel 7 Analisis hasil stabilitas yang dipercepat
3.8 Batas Kosong
Tidak ada kontrol templat (NTC) yang merupakan pengenceran templat dengan 96 pengulangan nilai CT >32 (ditambah garis ambang kalibrasi ROX yang ditetapkan sebesar 0,06).
Gambar 4 Hasil percobaan NTC
- 4.Referensi
4.1 Komisi Farmakope Tiongkok (ChPC). Farmakope Republik Rakyat Tiongkok (Vol Ⅲ) [S]. Beijing：China Medical Science and Technology Press，hal.542-543, 2020.
4.2 NMPA, 2007: Prinsip Umum untuk Tinjauan Teknis Validasi Metode Analisis untuk Pengendalian Mutu Produk Biologi.
4.3 ICH(2022)《Validasi metode analisis Q2》, versi draf.
Informasi Pemesanan
| Keterangan | Nomor Bagian |
| 41332ES | |
| 41331ES | |
| 41307ES | |
| 41308ES | |
| 18461ES | |
| Kit Deteksi qPCR MycAway™ Mycoplasma (2G) | 40619ES |